Smad3 est essentiel pour la polarisation de la tumeur

Jun 16, 2023

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 1794 (2023) Citer cet article

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Les neutrophiles sont dynamiques avec leur phénotype et leur fonction façonnés par le microenvironnement, tels que les états antitumoral N1 et protumoral N2 au sein du microenvironnement tumoral (TME), mais sa régulation reste indéfinie. Ici, nous examinons la signalisation TGF-β1/Smad3 dans les neutrophiles associés aux tumeurs (TAN) chez les patients atteints de carcinome pulmonaire non à petites cellules (NSCLC). L'activation de Smad3 dans les TAN N2 est négativement corrélée à la population N1 et à la survie des patients. Dans le carcinome pulmonaire expérimental, les TAN passent d'un état N2 prédominant chez les souris de type sauvage à un état N1 chez les souris Smad3-KO qui s'associent à une infiltration accrue de neutrophiles et à une régression tumorale. La déplétion des neutrophiles annule le phénotype anticancéreux N1 chez les souris Smad3-KO, tandis que le transfert adoptif des neutrophiles Smad3-KO reproduit cet effet protecteur chez les souris de type sauvage. L'analyse unicellulaire révèle un sous-ensemble de TAN montrant un phénotype N1 mature dans Smad3-KO TME, alors que les TAN de type sauvage conservent principalement un état N2 immature dû à Smad3. Mécaniquement, les gènes cibles Smad3 induits par TME liés à la détermination du destin cellulaire pour préserver l'état N2 de TAN. Il est important de noter que la suppression génétique et l'inhibition pharmaceutique de Smad3 améliorent la capacité anticancéreuse des neutrophiles contre le NSCLC en favorisant leur maturation N1. Ainsi, nos travaux suggèrent que la signalisation Smad3 dans les neutrophiles pourrait représenter une cible thérapeutique pour l'immunothérapie du cancer.

Le cancer demeure l'une des principales causes de décès dans le monde1,2. Les cellules cancéreuses sont hétérogènes, polyvalentes et adaptables, entraînant une résistance primaire et secondaire3. En effet, seule une petite population de patients atteints d'un cancer du poumon avancé répond à l'immunothérapie4. Cependant, plutôt que de cibler directement les cellules tumorales, la modification de la fonction de types de cellules spécifiques - en particulier les cellules immunitaires - dans le microenvironnement tumoral (TME) est une stratégie alternative puisque la croissance, l'invasion et les métastases du cancer dépendent des conditions stromales5. Ainsi, une meilleure compréhension de l'immunodynamique du TME peut découvrir de nouvelles stratégies pour le développement de thérapies anticancéreuses efficaces.

Les leucocytes constituent une composante importante des cellules stromales dans le cancer du poumon, avec un nombre variable de lymphocytes T, de lymphocytes B, de macrophages, de cellules dendritiques, de mastocytes et de granulocytes6. Alors que la contribution de la plupart de ces types de cellules immunitaires à la croissance tumorale a été étudiée en détail, le rôle des neutrophiles est moins bien compris. Considéré à l'origine comme des spectateurs neutres, il est maintenant évident que le TME peut induire une polarisation des neutrophiles dans différents états fonctionnels7. Au sein du TME, les neutrophiles peuvent être polarisés vers un état antitumoral N1 ou vers un état protumoral N28. Cependant, les mécanismes régulant cette polarisation restent à être pleinement explorés.

Le TGF-β est un puissant facteur immunosuppresseur et de différenciation qui peut favoriser la croissance tumorale9. Le traitement avec une petite molécule inhibitrice de la signalisation du récepteur TGF-β a considérablement réduit la croissance d'une tumeur de mésothéliome de souris en association avec une augmentation des lymphocytes T CD8 +10. Cet effet protecteur était également associé à une augmentation des neutrophiles associés aux tumeurs (TAN) et à la polarisation des neutrophiles vers un état antitumoral N18,11. Des études supplémentaires ont montré que le TGF-β peut stimuler un phénotype neutrophile protumoral N2, mais les mécanismes sous-jacents sont restés incertains12,13. Le complexe récepteur TGF-β peut engager à la fois la signalisation canonique dépendante de Smad et la signalisation non canonique indépendante de Smad14,15. De nouvelles preuves indiquent l'importance de Smad3 dans le TME du cancer du poumon. L'activation (phosphorylation) de SMAD3 dans les cellules immunitaires était négativement associée à la survie globale et sans maladie des patients atteints d'un cancer du poumon, indépendamment de leurs sous-types histologiques16. Un rôle critique de la signalisation canonique TGF-β/Smad3 dans le développement du cancer a été démontré par la réduction substantielle de la croissance tumorale observée chez les souris déficientes en gène Smad3 (Smad3-KO)17. Alors que la signalisation TGF-β/Smad3 supprime l'activité des cellules tueuses naturelles (cellules NK) et favorise l'accumulation de fibroblastes associés au cancer17,18, la contribution de la signalisation TGF-β/Smad3 dans la polarisation des TAN et la croissance tumorale reste inconnue.

Ici, nous montrons que l'activation de Smad3 dans les TAN est associée à un état de polarisation N2 prédominant et à un mauvais résultat chez les patients atteints de carcinome pulmonaire non à petites cellules (NSCLC). Les souris Smad3-KO présentent une infiltration accrue de neutrophiles et un passage à un état antitumoral N1 prédominant dans un modèle de cancer du poumon. Un rôle fonctionnel de ces TAN Smad3-KO N1 dans l'inhibition de la croissance tumorale est confirmé par des études de déplétion des neutrophiles, tandis que le transfert adoptif des neutrophiles Smad3-KO inhibe la croissance tumorale chez les souris de type sauvage. De plus, les neutrophiles Smad3-KO montrent la destruction accrue des cellules tumorales in vitro. L'analyse intégrée du transcriptome et de la liaison de la chromatine au niveau de la cellule unique montre que Smad3 induit la transcription de gènes favorisant un état protumoral N2 dans les TAN, alors que, sans Smad3, ces TAN se différencient davantage en un état antitumoral N1. Ainsi, l'inhibition de Smad3 est identifiée comme une stratégie thérapeutique pour favoriser la polarisation des TAN vers un état antitumoral N1 et ainsi supprimer le développement du cancer du poumon.

Nous avons étudié l'activation de SMAD3 (phosphorylation) dans TAN dans une banque d'échantillons de tissus NSCLC. Les neutrophiles ont été identifiés par l'expression de l'antigène CD16b19, 20, 21, qui a été validé dans un échantillon frais de NSCLC par cytométrie en flux qui a démontré des populations distinctes de neutrophiles CD16b + et de macrophages CD68 + (Fig. 1A supplémentaire). L'immunocoloration multicolore a identifié les cellules iNOS + CD16b + et CD206 + CD16b +, désignées respectivement par N1 et N2 TAN (Fig. 1A, B). Les TAN à l'état N1 représentaient un faible pourcentage des cellules CD16b + totales dans les tumeurs NSCLC et dans le tissu pulmonaire témoin. En revanche, les TAN à l'état N2 représentaient plus de 50 % des cellules CD16b + totales dans les tumeurs, mais moins de 10 % des cellules CD16b + dans le tissu pulmonaire témoin (Fig. 1C). La coloration par immunoperoxydase a montré de nombreux p-SMAD3 + dans les tumeurs par rapport à quelques cellules colorées dans le tissu pulmonaire témoin (Fig. 1B supplémentaire). L'imagerie confocale tridimensionnelle a montré une coloration p-SMAD3 dans de nombreux TAN CD206 + CD16b + N2 (Fig. 1D). De manière inattendue, la phosphorylation de SMAD3 était négativement corrélée au pourcentage de cellules N1 dans les TAN CD16b + totaux, mais n'était pas corrélée au pourcentage de TAN N2 chez les patients atteints d'adénocarcinome pulmonaire dans notre cohorte de patients (n = 72, Fig. 1E, F et tableau supplémentaire 1 ). Sur la base de la valeur médiane, une abondance plus élevée de TAN N1 (≥ 10 % de la surface) était associée à une meilleure survie sans maladie chez les patients atteints de NSCLC (Fig. 1G et données supplémentaires 1), alors qu'un N1/N2 ou N1/ Le rapport p-SMAD3 + TAN était associé à la progression de la maladie (Fig. 1C, D supplémentaire). Ces résultats démontrent une association entre l'activation de SMAD3 et la polarisation N1/N2 dans la progression du cancer.

A–C L'imagerie confocale et la quantification montrent une accumulation marquée de TAN N2 (cellules CD206+CD16b+) dans le NSCLC par rapport au tissu pulmonaire normal adjacent, ce qui contraste avec la petite population de TAN N1 (cellules iNOS+CD16b+) (**P < 0,01 vs poumon normal ; test t bilatéral). D Image confocale tridimensionnelle montrant l'activation de SMAD3 (p-SMAD3, bleu) dans de nombreux TAN N2 (cellules CD206+CD16b+) dans le NSCLC. L'analyse de corrélation montre que l'activation de Smad3 (E) a une corrélation négative avec la proportion de N1 TAN (F) mais n'est pas corrélée avec la proportion de N2 TAN (test bilatéral de corrélation de Pearson). GA une faible proportion de TAN N1 est significativement associée à une mortalité plus élevée des patients dans le NSCLC (test du log-rank (Mantel-Cox)). Barre d'échelle, 50 μm. Les données A–D représentent la moyenne ± SEM de trois patients/groupe. E–G Données basées sur une cohorte de 72 patients. Les valeurs P exactes du poumon normal par rapport au tissu NSCLC sont 1C. P = 0,0655(N1 TAN) et P = 0,004(N2 TAN). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Le rôle de Smad3 dans la régulation du recrutement et de la polarisation des neutrophiles dans le cancer du poumon a été étudié chez des souris de type sauvage (Smad3-WT) et Smad3-knockout (Smad3-KO) à l'aide du modèle cellulaire syngénique du carcinome pulmonaire de Lewis (LLC)14,17. Les tumeurs LLC chez les souris de type sauvage ont montré de nombreuses cellules p-Smad3 +, avec une coloration bicolore montrant de nombreux neutrophiles Ly6G + présentant également une coloration p-Smad3 (Fig. 2A et Fig. 2A supplémentaire). Les souris Smad3-KO inoculées avec des cellules LLC ont montré une augmentation marquée de l'abondance des neutrophiles dans la circulation et le TME, comme le montrent l'immunocoloration et la cytométrie en flux, ainsi qu'une croissance tumorale nettement inférieure au jour 15 par rapport aux témoins de type sauvage (Fig. 2A–C et supplémentaires Fig. 2A, B). Alors que les tumeurs LLC présentaient une coloration p-Smad3 chez les souris Smad3-KO (Fig. 2A), cette coloration était absente des TAN Ly6G + et a été attribuée à l'activation de Smad3 dans les cellules tumorales LLC (Fig. 2A, B supplémentaires). Les tumeurs LLC chez les souris de type sauvage présentaient une forte proportion de TAN avec un phénotype N2 (cellules CD206 + Ly6G +) et de faibles niveaux de TAN avec un phénotype N1 (cellules iNOS + Ly6G +). En revanche, les neutrophiles du TME chez les souris Smad3-KO contenaient une faible proportion de N2 et une forte proportion de cellules de phénotype N1 (Fig. 2D, E et Supplémentaire Fig. 2C, D), ce qui implique un rôle pour Smad3 dans le N1/ Polarisation N2 de TAN dans le cancer du poumon.

Une imagerie confocale et une cytométrie en flux B, montrent une augmentation des neutrophiles Ly6G+ dans la circulation et dans le TME des souris Smad3-KO porteuses de LLC par rapport aux témoins de type sauvage (Smad3-WT) (**P < 0,01, *** P < 0,001 vs Smad3-WT, test t bilatéral). Les souris C Smad3-KO présentent des tumeurs plus petites que les témoins Smad3-WT au jour 15 (** P < 0,01 par rapport à WT, test t bilatéral). D L'analyse par immunofluorescence et cytométrie en flux E a montré une faible proportion de N1 (iNOS + Ly6G +) et une forte proportion de TAN de phénotype N2 (CD206 + Ly6G +) chez les souris Smad3-WT, ce qui est inversé chez les souris Smad3-KO qui montrent une forte abondance de N1 et une faible abondance de TAN N2 (***P < 0,01 vs WT, test t bilatéral). Barres d'échelle, 50 μm. Les données A–E représentent la moyenne ± SEM de cinq souris/groupe. Les valeurs P exactes de WT vs KO sont 2A. P = 0,0002 (TAN dans TME), 2B. P = 0,002 (neutrophile circulant), P = 0,0004 (TAN), P = 0,0078 (nombre de TAN normalisé). 2C. P = 0,0011. 2D. P = 0,0003(N1 TAN), P = 0,0002(N2 TAN). 2E. P = 0,0002 (N1 TAN), P = 0,0005 (N2 TAN). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour capturer le profil transcriptome des populations TAN, nous avons utilisé le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour isoler les neutrophiles Ly6G + CD11b + à partir de tumeurs LLC disséquées à partir de souris Smad3-WT et Smad3-KO et avons effectué un séquençage d'ARN unicellulaire 10X (scRNA-seq) 14 (Fig. 3A supplémentaire). Dans notre ensemble de données unicellulaires, nous avons trié 4116 cellules des TAN Smad3-WT et 2514 cellules des TAN Smad3-KO avec une médiane de 1311 identifiants moléculaires uniques (UMI) avec 603 gènes par cellule (tableau supplémentaire 2). L'ensemble de données a ensuite été filtré en fonction de plusieurs marqueurs spécifiques aux neutrophiles (S100a9, S100a8, Csf3r et Il1rn)22, ce qui a donné 3293 TAN Smad3-WT et 1323 TAN Smad3-KO retenus pour l'analyse en aval (Fig. 3B supplémentaire). En fusionnant les deux ensembles de données nettoyés, nous avons détecté des signatures de transcriptome distinctes des TAN Smad3-WT (rouge) et Smad3-KO (bleu) (Fig. 3A, Fig. 4A supplémentaire et Données supplémentaires 2), où les marqueurs N1 (Tnf, Icam1 , et Fas) étaient fortement exprimés dans les clusters Smad3-KO, tandis que les marqueurs N2 (Arg1, Ccl2 et Vegf-b) étaient fortement exprimés dans les clusters Smad3-WT (Fig. 3B). Les TAN Smad3-WT et KO ont ensuite été regroupés de manière impartiale dans P1 à P8 en fonction de leur profil de transcriptome (Fig. 3C, D, Fig. 4B supplémentaire, Tableau supplémentaire 3 et Données supplémentaires 2), où P1 est un cluster spécifique à WT avec L'expression du marqueur N2 et P8 est un groupe spécifique de KO avec l'expression des marqueurs N1, comme indiqué dans les tracés t-SNE (Fig. 3E). Par comparaison avec les signatures génétiques rapportées des TAN N1 et N223, nous avons identifié que le groupe P1 spécifique au WT correspondait aux TAN N2, tandis que le groupe P8 spécifique au KO correspondait aux TAN N1 (Fig. 3F et données supplémentaires 2). Les gènes différentiellement exprimés (DEG) régulés positivement du cluster P8 spécifique de Smad3-KO étaient fortement associés à des fonctions antitumorales (réponse immunitaire et régulation positive de la destruction cellulaire), tandis que les fonctions protumorales (angiogenèse et régulation positive de la prolifération cellulaire) étaient liées à la Cluster P1 spécifique à Smad3-WT (Fig. 3G, H et données supplémentaires 2). De plus, nous avons observé un changement phénotypique progressif de l'expression du marqueur N2 en N1 dans les clusters P1 à P8 (Fig. 3I), suggérant un rôle régulateur de Smad3 dans le développement des neutrophiles.

Les TAN (cellules Ly6G + CD11b +) triées à partir de tumeurs LLC chez des souris Smad3-WT et Smad3-KO (regroupées à partir de huit tumeurs / groupe) ont subi un scRNA-seq. Un tracé t-SNE et une carte thermique de l'ensemble de données filtré scRNA-seq montrent des profils de transcriptome distincts des TAN des souris Smad3-WT (rouge) et Smad3-KO (bleu). Le graphique d'expression B montre que les TAN Smad3-KO expriment principalement des marqueurs d'un phénotype N1 (Tnf, Icam1 et Fas), tandis que les TAN Smad3-WT expriment principalement des marqueurs d'un phénotype N2 (Arg1, Ccl2 et Vegf-b). Carte thermique C et graphique D t-SNE montrant les 100 principaux gènes exprimés différentiels (DEG) et la relation entre huit groupes (P1 à P8) de Smad3-WT et -KO TAN regroupés de manière impartiale à l'aide de la méthode de Louvain. Les tracés E t-SNE montrent l'enrichissement des marqueurs N2 (Arg1, Ccl2 et Vegf-b) dans le cluster P1 spécifique à Smad3-WT et l'enrichissement des marqueurs N1 (Tnf, Icam1 et Fas) dans le P8 spécifique à Smad3-KO grappe. L'analyse F Heatmap indique en outre que les clusters P1 et P8 partagent des signatures de transcriptome avec les TAN N2 et N1, respectivement, comme défini par la réf. 23. Le graphique G Volcano montre le profil distinct du transcriptome de P8 par rapport à P1 (signification statistique calculée par Loupe Cell Browser). L'analyse H GO de gènes exprimés de manière différentielle (DEG) régulés à la hausse extraits de clusters spécifiques de Smad3-WT (P1) et Smad3-KO (P8) révèle que les TAN Smad3-KO ont acquis des fonctions anticancéreuses via la destruction des cellules et les réponses immunitaires, par rapport aux TAN Smad3-WT qui présentent un phénotype protumoral avec des fonctions d'angiogenèse et de régulation positive de la prolifération cellulaire. (Benjamini–Hochberg–test t bilatéral corrigé). I Dot plot visualisant le changement d'expression des marqueurs N1 et N2 dans les clusters P1 à P8, suggérant un rôle régulateur de Smad3 dans le changement phénotypique des TAN.

Pour élucider le rôle régulateur potentiel de Smad3 dans le développement des neutrophiles dans le TME, nous avons effectué une analyse de la vitesse de l'ARN pour retrouver la voie de développement des TAN Smad3-WT et -KO dans la tumeur LLC avec une résolution unicellulaire. De manière inattendue, nous avons constaté que le TAN spécifique à Smad3-WT (groupe 3) peut être progressivement transféré dans le TAN spécifique à Smad3-KO (groupe 2) indiqué par leurs flèches de direction de développement sur la figure 4A. Fait intéressant, nous avons observé que les phénotypes N2 (Arg1, Ccl2 et Vegf-b) et N1 (Fas, Icam1 et Tnf) étaient respectivement associés aux niveaux d'expression des neutrophiles immatures (Stmn1 et Ube2c) et matures (Il-1b et Csf3r ) marqueurs dans les TAN de manière dépendante de Smad3 (Fig. 4B, C); suggérant que Smad3 peut supprimer le phénotype N1 en limitant la maturation du TAN dans le TME. Pour valider l'hypothèse, nous avons examiné le schéma de développement et les connexions potentielles des clusters Smad3-WT et -KO TAN sur la figure 3D avec le pipeline MetaCell25 et les signatures transcriptionnelles26. De manière encourageante, nous avons détecté une forte connexion développementale entre les TAN Smad3-WT et -KO (Fig. 4D) et un état de maturation progressif du cluster P1 spécifique à Smad3-WT au cluster P8 spécifique à Smad3-KO au niveau transcriptionnel (Fig. .4E et données supplémentaires 2). De plus, nous avons caractérisé les clusters intermédiaires P2 à P7 en fonction de leurs fonctions de neutrophiles matures (par exemple, chimiotaxie, production de granules et processus de biosynthèse des ROS27), révélant que P2-P3 appartiennent à des neutrophiles immatures avec un phénotype de type N2 tandis que P4-P7 ont montré une maturation progressive vers un phénotype N1 complètement développé (Fig. 3I, 4E et Fig. 5A supplémentaire). De plus, nous avons également confirmé les résultats en reconstruisant les voies de développement des TAN Smad3-WT et Smad3-KO sur la base des niveaux d'expression des marqueurs N1 (Tnf) et N2 (Ccl2) avec analyse pseudo-temporelle (Fig. 4F), où N1/ Les marqueurs N2 et les gènes de développement des neutrophiles peuvent être cartographiés avec succès le long de la voie pseudo-temporelle (Fig. 5B, C supplémentaires). Ainsi, nos découvertes ont découvert une direction développementale de TAN de N2 à N1 dans TME, qui peut être bloquée par le rôle inhibiteur de Smad3 dans la maturation des neutrophiles.

A Les flèches dans le diagramme de diffusion de l'analyse de la vitesse de l'ARN de l'ensemble de données TAN de la Fig. 3A indiquent que la population Smad3-KO N1 (cluster 2, vert) est dérivée du Smad3-WT N2 (cluster 3, rouge) comme indiqué par : B expression des marqueurs de maturation des neutrophiles, C expression des marqueurs N1/N2 et D affectation de la lignée cellulaire (k-NN) Graphique du réseau MetaCell montrant la relation de développement entre Smad3-WT et KO TAN de la Fig. 3A. E Diagramme en points montrant le gradient de transcription de l'expression du gène de développement des neutrophiles du P1 immature au cluster P8 mature. La taille et la couleur des cercles représentent la valeur du changement de pli log2 et la direction du changement d'expression, respectivement, des gènes de développement des neutrophiles (panneau inférieur) dans chaque groupe. F L'analyse pseudo-temporelle de l'ensemble de données TAN scRNA-seq a clairement visualisé une trajectoire étendue du phénotype Smad-WT N2 (Ccl2+) vers le phénotype Smad3-WT N1 (Tnf+) dans la tumeur LLC, où G Smad3-KO TAN (397/429 cellules = 92,5%) ont conservé un phénotype N1 par rapport aux cellules Smad3-WT (199/1111 cellules = 17,9%). L'analyse H RT-PCR du milieu conditionné LLC stimulé par BMDN montre un changement de facteur accru des marqueurs N1 (iNOS, Tnf-α et Icam1) dans les neutrophiles Smad3-KO, tandis que les neutrophiles Smad3-WT ont montré des niveaux accrus de marqueurs N2 (CD206, Vegf, et Arg1) (*P < 0,05, ***P < 0,001 vs WT-BMDN, n = 3 échantillons indépendants, ANOVA unidirectionnelle). Les données H représentent la moyenne ± SEM de trois expériences indépendantes. Les valeurs P exactes de WT-BMDN par rapport à KO-BMDN sont 4H. P = 0,0001 (iNOS), P = 0,0001 (Tnf-α), P = 0,0149 (Icam1), P = 0,001 (CD206), P = 0,0001 (Vegf) et P = 0,0211 (Arg1). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

De plus, nous avons encore validé nos résultats du modèle expérimental de carcinome pulmonaire avec un ensemble de données public de scRNA-seq dérivé de patients atteints de NSCLC pour garantir sa pertinence clinique. Les TAN humains de l'ensemble de données ont été regroupés par réduction de dimensionnalité avec UMAP et regroupement basé sur l'expression de gènes marqueurs (CSF3R, FPR1, NAMPT, MNDA et FCGR3B) selon le protocole 10x Genomics (Fig. 6A supplémentaire). De manière constante, les marqueurs immatures des neutrophiles (STMN1, UBE2S et TUBA1B) étaient régulés à la baisse dans les TAN humains SMAD3-ve du NSCLC associés à leur signature N1 (Fig. 6B, C supplémentaires)23. Conformément à cette notion, la suppression génétique et l'inhibition pharmacologique de Smad3 ont entraîné un développement accru de N1 de neutrophiles dérivés de la moelle osseuse de souris (BMDN) stimulés avec un milieu conditionné de cellules cancéreuses LLC (LLC-CM) in vitro, arguant que Smad3 limite la maturation de TAN dans le cancer du poumon (Fig. 4H et Fig. 7 supplémentaire). Par conséquent, Smad3 peut représenter une cible thérapeutique potentielle pour renforcer l'immunité anticancéreuse N1 dans le cancer du poumon.

Nous avons étudié la contribution des neutrophiles Smad3-WT et Smad3-KO dans la croissance tumorale LLC par déplétion des neutrophiles en utilisant l'anticorps anti-Ly6G (clone 1A8)11,28. L'épuisement des neutrophiles, qui a été validé par immunocoloration dans les tissus tumoraux (Fig. 8 supplémentaire), a entraîné une augmentation marquée de la croissance tumorale chez les souris Smad3-KO, mais n'a pas affecté la croissance tumorale chez les témoins de type sauvage (Fig. 5A, B et Fig. 8 supplémentaire).

Les souris A, B Smad3-WT et Smad3-KO ont été traitées avec des IgG anti-Ly6G ou témoins en commençant 3 jours avant l'inoculation avec des cellules LLC et tuées au jour 16 et analysées pour ; Taille de la tumeur A et poids de la tumeur B (*P < 0,05, ***P < 0,001 par rapport aux souris Smad3-WT traitées aux IgG ; ##P < 0,01, ###P < 0,001 par rapport aux souris Smad3-KO traitées aux IgG souris ; ANOVA unidirectionnelle). C – F Le transfert adoptif de Smad3-knockout (KO-BMDN), mais pas de BMDN de type sauvage (WT-BMDN), aux jours 15 et 20 a inhibé de manière significative la croissance des tumeurs LLC chez les souris Smad3-WT, comme le montre : Tumeur C taille et poids de la tumeur D, au jour 25. E L'immunohistochimie et la coloration H&E montrent que le transfert adoptif de WT-BMDN augmente la proportion de neutrophiles dans le TME dans les tumeurs LLC, tandis que le transfert de KO-BMDN a entraîné une proportion encore plus grande de neutrophiles dans le TME. F L'immunomarquage montre que le transfert de WT-BMDN n'a pas affecté les proportions de N1 et N2 TAN dans le TME, alors que le transfert de KO-BMDN a provoqué un changement substantiel dans la proportion de N1 et N2 TAN. (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs Contrôle, ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs WT-BMDN, ANOVA unidirectionnelle). Barres d'échelle, 50 μm. Les données A–F représentent la moyenne ± SEM de 4 souris/groupe. Les valeurs P exactes du traitement IgG vs anti-Ly6G sont de 5A. P = 0,0001 (IgG KO contre IgG WT, J14), P = 0,0122 (anti-Ly6G KO contre IgG WT, J14), P = 0,0049 (anti-Ly6G KO contre IgG KO, J14), P = 0,0001 ( IgG KO contre IgG WT, J16), P = 0,0001 (anti-Ly6G KO contre IgG WT, J16), P = 0,0085 (anti-Ly6G KO contre IgG KO, J16), 5B. P = 0,0001 (IgG KO contre IgG WT), P = 0,0001 (anti-Ly6G KO contre IgG WT) et P = 0,0003 (anti-Ly6G KO contre IgG KO). Les valeurs P exactes du transfert adoptif BMDN sont 5C. P = 0,0001 (KO-BMDN contre WT-BMDN, J20), P = 0,0001 (KO-BMDN contre Témoin, J20), P = 0,007 (KO-BMDN contre WT-BMDN, J25), P = 0,0009 ( KO-BMDN contre contrôle, D25). 5D. P = 0,0068 (KO-BMDN contre WT-BMDN), P = 0,0014 (KO-BMDN contre Contrôle), 5E. P = 0,0013 (KO-BMDN contre WT-BMDN, Ly6G), P = 0,0001 (KO-BMDN contre Contrôle, Ly6G), P = 0,0226 (WT-BMDN contre Contrôle, Ly6G), P = 0,0018 (KO- BMDN vs WT-BMDN, H&E), P = 0,0001 (KO-BMDN vs Control, H&E), P = 0,0001 (WT-BMDN vs Control, H&E). 5F. P = 0,0001 (KO-BMDN contre WT-BMDN, N1 TAN), P = 0,0001 (KO-BMDN contre Contrôle, N1 TAN), P = 0,0205 (WT-BMDN contre Contrôle, N1 TAN), P = 0,0001 (KO-BMDN contre WT-BMDN, N2 TAN), P = 0,0001 (KO-BMDN contre Contrôle, N2 TAN), P = 0,0039 (WT-BMDN contre Contrôle, N2 TAN). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Une approche de transfert adoptif a été utilisée comme stratégie supplémentaire pour examiner comment les neutrophiles Smad3-KO et Smad3-WT peuvent affecter la croissance tumorale. Des souris de type sauvage avec des tailles de tumeurs appariées ont été injectées aux jours 15 et 20 avec des BMDN Smad3-WT ou Smad3-KO triés par MACS, et les tumeurs ont été évaluées au jour 25 (Fig. 9 supplémentaire). Le transfert de BMDN de type sauvage n'a pas affecté la croissance tumorale malgré l'augmentation évidente du nombre de TAN, bien que l'équilibre N1 / N2 des TAN n'ait pas été affecté (Fig. 5C – F). En revanche, le transfert adoptif de Smad3-KO-BMDN a provoqué une réduction substantielle de la croissance tumorale en association avec une augmentation encore plus importante des TAN totaux, qui présentaient un phénotype N1 dominant (Fig. 5C – F). Le recrutement amélioré de Smad3-KO-BMDN par rapport à celui de Smad3-WT-BMDN dans le TME a été démontré dans une expérience de transfert adoptif dans laquelle des nombres égaux de Smad3-WT et de Smad3-KO-BMDN marqués par un colorant ont été injectés dans des souris porteuses de tumeurs , et le TME examiné 24 h plus tard (Fig. 10 supplémentaire). Enfin, nous avons dosé l'activité antitumorale de Smad3-WT et Smad3-KO-BMDN en co-culture avec des cellules LLC. Smad3-KO-BMDN présentait une liaison accrue aux cellules LLC, une cytotoxicité beaucoup plus importante envers les cellules LLC et une phagocytose accrue des cellules LLC par rapport à Smad3-WT-BMDN (Fig. 6A – C et Fig. 11 supplémentaire). En somme, ces résultats identifient Smad3 comme un immunorégulateur qui facilite la croissance tumorale via la polarisation des neutrophiles vers un phénotype N2 au sein du TME.

A – C Smad3-WT et Smad3-KO-BMDN ont été co-cultivés avec des cellules LLC et analysés ; Une liaison du BMDN aux cellules LLC, B la mort des cellules LLC à différents rapports de BMDN aux cellules LLC et C la phagocytose des cellules LLC marquées au Dil (** P < 0,01, *** P < 0,001 vs WT-BMDN, n = 3 échantillons indépendants, test t bilatéral) respectivement. D – J Smad3-WT-BMDN (regroupés à partir de 4 souris / groupe) ont été cultivés avec 10% de LLC-CM ou un milieu normal (contrôle) pendant 2 h et analysés par ChIP-seq spécifique à Smad3. Un changement substantiel dans la liaison de Smad3 au génome était évident dans le BMDN stimulé par LLC-CM, comme le montre ; Analyse de carte thermique D, E, graphique de région de chevauchement F, graphique d'enrichissement G, graphique de corrélation H et analyse de motif de liaison I. L'annotation J Gene Ontology (GO) révèle que Smad3 régule directement les gènes associés au développement et à la différenciation cellulaires dans les BMDN stimulés par LLC-CM. Profils d'expression des gènes cibles de Smad3 (K) liés au développement des neutrophiles (Afdn, Cdon, Elf4enif1 et Limd1) (signification statistique calculée à partir du package Monocle) et L leur annotation fonctionnelle le long des TAN de la voie de développement (comme sur la Fig. 3I). M Graphique d'expression des gènes cibles N1 (Smad9l et Zc3h7a) et N2 (Chl1 et Ly6c1) Smad3 dans les TAN Smad3-WT et Smad3-KO. Barre d'échelle, 50 μm. Les données A–C représentent la moyenne ± SEM de trois expériences indépendantes. Les valeurs P exactes de WT-BMDN par rapport à KO-BMDN sont de 6A. P = 0,0021. 6B. P = 0,0001 (1:10), P = 0,0001 (1:20). 6C. P = 0,003. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Smad3 est un facteur de transcription qui facilite certaines des actions pathologiques du TGF-β1 dans la maladie14,29. Par conséquent, nous avons étudié les promoteurs de gènes auxquels Smad3 se lie dans les neutrophiles au niveau génomique. Les BMDN isolés de souris de type sauvage ont été cultivés pendant 2 h avec ou sans milieu conditionné de cellules LLC (LLC-CM) puis dosés par séquençage ChIP. Par rapport aux cellules témoins, la stimulation LLC-CM a considérablement modifié le schéma de liaison Smad3 dans le génome de BMDN (Fig. 6D, H). Les motifs de liaison Smad3 ont été cartographiés sur le génome de BMDN dans des conditions de contrôle et de stimulation LLC-CM. Cela a identifié 64 gènes cibles directs de Smad3 sous stimulation LLC-CM, y compris des gènes candidats responsables du développement et de la différenciation cellulaires (Fig. 6I, J et données supplémentaires 3). Il convient de noter que nous avons identifié plusieurs facteurs de développement des neutrophiles N2 (tels que Afdn30, Cdon31, Elf4enif132 et Limd133) en tant que gènes cibles Smad3 dans des conditions de stimulation LLC-CM (Fig. 6K). De plus, l'interrogation de la voie de développement reconstruite à partir de l'ensemble de données TAN scRNA-seq avec les gènes cibles Smad3 identifiés par ChIP-seq a identifié l'enrichissement de ces gènes à l'état N2 (Fig. 6L). En comparant les TAN totaux de Smad3-WT et de Smad3-KO, nous avons confirmé que les niveaux d'expression des gènes cibles de Smad3 par ChIP-seq étaient associés aux états N1 et N2 qui fonctionnent de manière dépendante de Smad3 (Fig. 6M). Ces résultats mettent en évidence le rôle régulateur de Smad3 dans la polarisation N1/N2 des TAN dans le carcinome pulmonaire.

Nous avons ensuite examiné si SMAD3 régule la polarisation N1/N2 et la destruction des tumeurs dans les neutrophiles humains in vitro et in vivo en utilisant la lignée cellulaire NSCLC humaine, A549. Tout d'abord, nous avons réduit au silence l'expression de SMAD3 dans les neutrophiles humains dérivés du sang périphérique (PBDN) par transfection d'ARNsi et évalué leur activité anticancéreuse contre les cellules A549 in vitro. Comme le montrent les figures 7A, B, le silence de SMAD3 dans le PBDN (S3KD-PBDN) a considérablement amélioré leur capacité à tuer les cellules A549 in vitro, par rapport au PBDN témoin traité par un non-sens (NC-PBDN). De plus, le transfert adoptif des S3KD-PBDN dans des souris NSG portant A549 a provoqué une inhibition significative de la croissance tumorale in vivo, alors que le transfert de NC-PBDN était sans effet (Fig. 7C). Contrairement à la polarisation N2 prédominante (cellules CD206 + CD16b +) avec activation SMAD3 de TAN chez les souris recevant NC-PBDN, il y avait une polarisation N1 prédominante (cellules iNOS + CD16b +) et un manque d'activation SMAD3 dans TAN de souris recevant S3KD- PBDN (figure 7D). Ces résultats montrent que l'inhibition de SMAD3 dans les neutrophiles humains favorise une polarisation N1 au sein du TME et une fonction antitumorale.

Une analyse RT-PCR montrant que la transfection de PBDN humain avec des siARN SMAD3 (S3KD-PBDN), mais pas avec des siARN témoins non-sens (NC-PBDN), supprime le milieu basal (contrôle) et le milieu conditionné A549 (A549 CM) stimulés pour augmenter SMAD3 expression (**P < 0,01 vs Contrôle, ###P < 0,001 vs NC-PBDN, n = 3 échantillons indépendants, ANOVA unidirectionnelle). B Les études de co-culture montrent une cytotoxicité accrue de S3KD-PBDN envers la lignée cellulaire NSCLC humaine A549 (** P < 0,01, *** P < 0,001, n = 3 échantillons indépendants, test t bilatéral). C, D Des souris immunodéprimées NSG ont été inoculées avec des cellules A549, puis ont reçu des injections de NC-PBDN ou S3KD-PBDN humains aux jours 15 et 20, puis tuées au jour 25. C Le transfert adoptif de S3KD-PBDN a entraîné une réduction significative de la taille de la tumeur et le poids, qui n'était pas apparent avec un transfert de NC-PBDN (*** P < 0,001 vs tumeurs A549 non traitées (témoin), ### P < 0,001 vs NC-PBDN, ANOVA unidirectionnelle). D L'immunomarquage des marqueurs neutrophiles humains a montré que le transfert adoptif de NC-PBDN entraînait une forte proportion de TAN présentant un phénotype N2 (cellules CD206+ CD16b+), tandis que le transfert de S3KD-PBDN entraînait une forte proportion de TAN présentant un phénotype N1 (iNOS+ cellules CD16b+). De plus, la coloration p-SMAD3 a été observée dans une forte proportion de N2, mais pas dans les TAN N1. (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs tumeurs A549 non traitées (témoin), ###P < 0,001 vs NC-PBDN, ANOVA à une voie) Barres d'échelle, 50 μm. A, B Les données représentent la moyenne ± SEM de trois expériences indépendantes. C, D Les données représentent la moyenne ± SEM de 4 souris/groupe. Les valeurs P exactes de NC-PBDN par rapport à S3KD-PBDN sont 7A. P = 0,001 (contrôle), P = 0,0001 (A549 CM-traité), P = 0,007 (NC-PBDN, contrôle vs A549 CM-traité). 7B. P = 0,017 (1:2), P = 0,0157 (1:5), P = 0,0077 (1:10). Les valeurs P exactes du traitement PBDN sont de 7C. P = 0,0002 (S3KD-PBDN contre NC-PBDN, J20), P = 0,0002 (S3KD-PBDN contre Contrôle, J20), P = 0,0001 (S3KD-PBDN contre NC-PBDN, J25), P = 0,0001 (S3KD -PBDN vs Control, J25), P = 0,0001 (S3KD-PBDN vs NC-PBDN, poids de la tumeur), P = 0,0001 (S3KD-PBDN vs Control, poids de la tumeur). 7D. P = 0,0001 (S3KD-PBDN contre NC-PBDN, N1 TAN), P = 0,0001 (S3KD-PBDN contre Contrôle, N1 TAN), P = 0,0068 (NC-PBDN contre Contrôle, N1 TAN), P = 0,0001 (S3KD-PBDN contre NC-PBDN, N2 TAN), P = 0,0404 (S3KD-PBDN contre Contrôle, N2 TAN), P = 0,0001 (NC-PBDN contre Contrôle, N2 TAN), P = 0,0001 (S3KD- PBDN contre NC-PBDN, SMAD3 + N2 TAN), P = 0,0398 (S3KD-PBDN contre Contrôle, SMAD3 + N2 TAN), P = 0,0001 (NC-PBDN contre Contrôle, SMAD3 + N2 TAN). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Enfin, nous avons demandé si une approche médicamenteuse pouvait être utilisée pour favoriser la polarisation N1 des TAN et réduire la croissance des tumeurs pulmonaires. Des souris de type sauvage ont reçu un traitement quotidien avec des doses variables de l'inhibiteur de Smad3, du SIS3 ou du véhicule, en commençant le jour 7 après l'inoculation avec des cellules LLC. Comparé au traitement par véhicule, le traitement SIS3 a montré une relation dose-réponse en termes de réduction de la taille et du poids de la tumeur, d'augmentation du nombre total de TAN et d'induction de la polarisation N1 pour modifier considérablement le rapport N1 / N2 (Fig. 8A – G). Pris ensemble, nos résultats identifient Smad3 comme un régulateur de la polarisation des neutrophiles N1/N2 au sein du TME et démontrent que Smad3 est une cible médicamenteuse pour améliorer l'activité antitumorale médiée par les neutrophiles dans le cancer du poumon.

Au jour 7, après inoculation avec des cellules LLC, les souris Smad3-WT ont reçu une administration quotidienne de différentes doses de l'inhibiteur de Smad3, SIS3, ou véhicule, jusqu'à ce que les souris soient tuées au jour 16. L'immunomarquage montre que le traitement SIS3 a augmenté la proportion de neutrophiles (Ly6G+ cellules) dans le TME (A, B), augmentation de la proportion de TAN N1 (iNOS+ Ly6G+) (C), diminution de la proportion de TAN N2 (CD206+ Ly6G+) (D), modification du rapport du phénotype N1/N2 dans les TAN (E) et suppression de la croissance et du poids de la tumeur LLC (F, G). (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs témoin véhicule, #P < 0,05, ##P < 0,01 vs SIS3 5 μg/g, ANOVA unidirectionnelle). Barres d'échelle, 50 μm. Les données A–G représentent la moyenne ± SEM de 4 souris/groupe. Les valeurs P exactes du traitement par rapport au contrôle sont de 8B. P = 0,016 (SIS3 5 μg/g vs véhicule), P = 0,0001 (SIS3 10 μg/g vs véhicule), 8C. P = 0,0001 (SIS3 2,5, 5, 10 μg/g par rapport au véhicule). 8D. P = 0,0001 (SIS3 2,5, 5, 10 μg/g par rapport au véhicule). 8E. P = 0,029 (SIS3 5 μg/g vs véhicule), P = 0,0001 (SIS3 10 μg/g vs véhicule). 8G. P = 0,0042 (SIS3 5 μg/g vs véhicule, taille de la tumeur), P = 0,0001 (SIS3 10 μg/g vs véhicule, taille de la tumeur), P = 0,0335 (SIS3 5 μg/g vs SIS3 10 μg/g , taille de la tumeur), P = 0,0042 (SIS3 5 μg/g vs véhicule, poids de la tumeur), P = 0,0001 (SIS3 10 μg/g vs véhicule, poids de la tumeur), P = 0,0273 (SIS3 5 μg/g vs. SIS3 10 μg/g, poids de la tumeur). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Les neutrophiles sont connus depuis longtemps pour jouer un rôle clé dans la réponse aux organismes infectieux, alors que leur rôle dans le développement du cancer n'est devenu que récemment un domaine de grand intérêt7,34. Dans cette étude, en résolvant la dynamique du transcriptome des neutrophiles dans le TME à une résolution unicellulaire, nous démontrons que Smad3 induit la polarisation de TAN vers un état N2 prédominant dans le cancer du poumon, tandis que la suppression de Smad3 induit une polarisation vers un état N1. Cette profonde différence de polarisation N1/N2 entre les TAN de type sauvage et Smad3-KO était fonctionnellement importante, comme le montre la puissante activité antitumorale des TAN Smad3-KO.

Fridlender et al. ont suggéré les termes N1 et N2 pour représenter respectivement les phénotypes antitumoraux et protumoraux des neutrophiles, apparentés aux phénotypes M1 et M2 des macrophages associés aux tumeurs11,35. Des études ultérieures ont identifié Tnf, Icam1 et iNOS comme gènes de signature pour le phénotype N1, avec Vegf-b, Arginase et Cd206 comme gènes de signature pour le phénotype N223,36,37. Notamment, les marqueurs antigéniques uniques ne sont pas capables d'identifier de manière unique les populations de neutrophiles N1 ou N2 ; cela nécessite l'utilisation d'un marqueur spécifique des neutrophiles en combinaison avec un ou plusieurs marqueurs supplémentaires. Par conséquent, dans les études sur la souris, nous avons utilisé une double coloration pour iNOS/Ly6G pour détecter les TAN à l'état N1 et la coloration CD206/Ly6G pour les TAN à l'état N2. Dans les études sur le NSCLC humain, nous avons utilisé la double coloration iNOS/CD16b et CD206/CD16b pour identifier les TAN N1 et N2, respectivement. Alors que les souris de type sauvage avec des tumeurs LLC présentaient un phénotype N2 prédominant dans le TME, les souris Smad3-KO présentaient une polarisation opposée avec un phénotype N1 prédominant dans les TAN. Dans les études humaines, le CD16b est considéré comme un marqueur spécifique des neutrophiles19,20,21. Cependant, il est important de reconnaître que les cellules immunitaires peuvent modifier l'expression de leur marqueur au cours d'une réponse immunitaire. Par conséquent, nous avons utilisé la cytométrie en flux pour valider que CD16b est exprimé par les neutrophiles, mais pas par les monocytes/macrophages CD68 +, dans le TME du NSCLC humain. Ainsi, une découverte importante de cette étude est une validation de CD16b/iNOS et CD16b/CD206 comme marqueurs pour identifier les TAN N1 et N2 humains, respectivement, en utilisant la cytométrie en flux ou la microscopie confocale.

La fonction de la signalisation TGF-β/Smad3 dans le cancer dépend fortement du contexte, avec des effets à la fois promoteurs et suppresseurs du cancer décrits dans la réf. 38. Une étude de biopsie du NSCLC à un stade précoce a révélé que la phosphorylation de SMAD3 dans les populations de lymphocytes T et dans les macrophages du TME avait un impact négatif sur la survie globale et partiellement sans maladie, bien que l'activation de SMAD3 dans les neutrophiles n'ait pas été évaluée16. Notre étude de biopsie dans le NSCLC étend ces résultats en démontrant que l'activation de SMAD3 est prédominante dans les TAN N2, que l'activation de SMAD3 est corrélée négativement avec le pourcentage de TAN à l'état N1 et qu'un pourcentage plus élevé de TAN N1 dans le TME est associé à une meilleure absence de maladie. survie.

Nous avons précédemment montré que les souris Smad3-KO présentent une réduction profonde de la croissance tumorale en utilisant les lignées cellulaires cancéreuses LLC et B16F10. Il est important de noter que la suppression de Smad3 uniquement dans le compartiment de la moelle osseuse était suffisante pour fournir cette protection17,39. Ici, nous montrons que les neutrophiles Smad3-KO se polarisent vers un état N1 avec un puissant effet antitumoral dans le modèle de cancer du poumon syngénique LLC. L'épuisement des neutrophiles chez les souris Smad3-KO a aboli la protection contre la croissance des tumeurs pulmonaires, établissant le rôle antitumoral des neutrophiles Smad3-KO. En revanche, la déplétion des neutrophiles chez les souris de type sauvage n'a eu aucun effet sur la croissance tumorale, arguant que malgré un phénotype protumoral prédominant N2 TAN, elles n'ont pas eu d'impact significatif sur le développement tumoral. En effet, l'utilisation de l'épuisement des neutrophiles dans des modèles murins de cancer du poumon a produit des résultats disparates, certains montrant des effets antitumoraux11,37, certains ne montrant aucun effet40,41 et d'autres montrant une croissance et des métastases accrues à la suite de l'épuisement des neutrophiles42,43. Pour étayer davantage la fonction des neutrophiles N1 Smad3-KO dans le développement du cancer du poumon, nous avons effectué des études de transfert adoptif, qui ont montré que l'administration de Smad3-KO-BMDN, mais pas de BMDN de type sauvage, pouvait supprimer la croissance tumorale. Cette découverte a été confirmée chez des souris immunodéprimées atteintes de la tumeur des cellules A549 dans laquelle le transfert adoptif de PBDN humain avec SMAD3 knock-down a supprimé la croissance tumorale, tandis que le PBDN témoin n'a eu aucun effet. De plus, la suppression ou l'inactivation de Smad3 dans les neutrophiles de souris ou humains a augmenté leur réponse cytotoxique aux cellules tumorales in vitro. Ensemble, ces expériences indépendantes indiquent que Smad3 entraîne un état protumoral N2 dans les TAN, tandis que la suppression/renversement de Smad3 expose un état N1 alternatif dans les TAN avec une puissante activité antitumorale.

L'application de l'ARN-seq unicellulaire fournit des informations importantes sur la régulation par Smad3 de la polarisation N1/N2 dans les TAN. Les informations dirigées sur la maturation TAN concernant les phénotypes N1 / N2 ont été démontrées par la vitesse de l'ARN et résolues avec l'analyse MetaCell via une analyse intensive des grappes en fonction des signatures génétiques du développement et des fonctions des neutrophiles26,27. Nous avons observé que N2 est un état précoce des TAN qui évolue progressivement vers un état N1 dans le TME. En utilisant le modèle d'expression des gènes de signature identifiant l'état N1 (Tnf, Fas), l'état N2 (Arg1, Ccl2) et les neutrophiles immatures (Stmn1, Ube2c), l'analyse pseudo-temporelle a confirmé la direction du développement des TAN avec N2 comme état précoce des TAN dans le TME du cancer du poumon. Nous avons également validé que nos résultats peuvent être appliqués aux TAN humains en interrogeant un ensemble de données NSCLC scRNA-seq. De plus, nous avons identifié que la déficience en Smad3 conduit la polarisation des TAN à un état N1 au niveau du transcriptome. Conformément à cette découverte, la culture de Smad3-KO-BMDN sous stimulation par des milieux conditionnés par des cellules tumorales a entraîné un phénotype N1 prédominant, tandis que le BMDN de type sauvage s'est polarisé en un phénotype N2 prédominant. De plus, les mécanismes par lesquels Smad3 régule la polarisation du BMDN stimulé avec des milieux de culture de cellules tumorales ont été étudiés au niveau du génome via ChIP-seq et une analyse bioinformatique impartiale. L'analyse de l'ontologie des gènes a montré que les cibles directes de Smad3 dans le BMDN stimulé sont associées au développement et à la différenciation cellulaire. De plus, nous avons également confirmé l'enrichissement de ces gènes cibles le long de l'analyse en pseudo-temps du développement de l'état N2. Il a été rapporté que certains de ces gènes cibles Smad3 mis en évidence sont liés au développement et à la fonction des neutrophiles ; par exemple, Elf4ebp1 a été impliqué dans la différenciation des neutrophiles, bien que dans la lignée cellulaire HL-6044. D'autres études sont nécessaires pour étudier comment ces gènes cibles Smad3 contribuent à la polarisation N2 dans le TME. Ensemble, ces données identifient Smad3 comme un régulateur clé de la polarisation N1/N2 des TAN opérant au niveau du génome et du transcriptome.

On sait que la signalisation TGF-β/Smad3 dans les leucocytes favorise la croissance tumorale en supprimant la cytotoxicité antitumorale par les lymphocytes T CD8+10 et NK9, et en favorisant la transition des macrophages associés à la tumeur en fibroblastes au sein du TME14. Ici, nous démontrons que la signalisation TGF-β/Smad3 favorise également la croissance tumorale en favorisant un état protumoral N2 dans les TAN. Notamment, alors que l'effet suppresseur de la signalisation Smad3 sur l'activité antitumorale des cellules NK ne peut être démontré que dans des modèles avec épuisement de l'immunité de fond9, nous montrons ici que les BMDN Smad3-KO sont efficaces pour supprimer la progression du cancer dans le TME immunocompétent. Une autre découverte intéressante était que la suppression de Smad3 entraînait une augmentation du recrutement des neutrophiles dans le TME. Cela était évident à la fois chez les souris Smad3-KO et avec un nombre accru de TAN suite au transfert adoptif de Smad3-KO par rapport à Smad3-WT-BMDN dans le modèle de cancer LLC. De plus, en utilisant le marquage par colorant, nous avons démontré que Smad3-KO-BMDN montre une infiltration accrue dans le TME des souris de type sauvage, arguant que ce recrutement accru n'est pas dû à des facteurs produits par le TME, mais plutôt à une différence dans la réponse du Smad3 -neutrophiles KO en soi. Cette infiltration accrue de neutrophiles Smad3-KO dans le TME est cohérente avec l'infiltration accrue de neutrophiles observée chez les souris Smad3-KO dans des modèles d'hypersensibilité de contact avec la peau et d'irradiation cutanée45,46. De plus, étant donné l'intérêt des neutrophiles pour l'administration spécifique de la tumeur de médicaments anticancéreux47,48, l'utilisation des neutrophiles Smad3-KO pourrait contribuer à cet effort.

Le ciblage de la signalisation du TGF-β dans le cancer est passé aux essais cliniques avec un inhibiteur de l'activité kinase du récepteur du TGF-β de type I (TGFBR1/ALK5), le Vactosertib, actuellement dans plusieurs essais, dont un essai de phase 2 dans le NSCLC (NCT04515979) . Cela s'appuie sur les travaux de la réf. 11, qui a montré que l'administration orale de l'inhibiteur de la kinase TGFBR1, SM16, supprimait la croissance d'une tumeur pulmonaire de souris en association avec une polarisation des neutrophiles vers un état antitumoral N1. Théoriquement, le ciblage de SMAD3 devrait provoquer moins d'effets secondaires que le ciblage de TGFBR1, ce qui permettrait un plus grand degré d'inhibition de SMAD3 par rapport au niveau tolérable d'inhibition de TGFBR1. Nous avons démontré une suppression très efficace de la croissance du cancer du poumon LLC en utilisant l'inhibiteur de Smad3, SIS3, qui était associé à un nombre accru de TAN et à la polarisation des TAN vers un état N1 prédominant. D'autres études sont justifiées pour comparer l'inhibition optimale de Tgfbr1 à l'inhibition optimale de Smad3 dans le modèle de tumeur LLC, et si un inhibiteur de Tgfbr1 offre un avantage supplémentaire lorsqu'il est administré à des souris Smad3-KO. Étant donné que des formes plus solubles du composé SIS3 ont été produites49, cela pourrait être un domaine fructueux pour une enquête plus approfondie.

En résumé, dans cette étude, nous définissons le rôle de Smad3 dans la polarisation des neutrophiles au sein du microenvironnement tumoral. Alors que la signalisation Smad3 favorise un état protumoral N2 dans les TAN, l'absence de Smad3 dans les neutrophiles entraîne le résultat opposé, avec une polarisation des TAN dans un état N1 avec une puissante activité antitumorale basée sur un recrutement accru et une cytotoxicité tumorale accrue. Ces connaissances peuvent être pertinentes pour le développement d'une immunothérapie à base de neutrophiles contre le NSCLC.

Anticorps monoclonaux utilisés pour l'immunomarquage et la cytométrie en flux inclus ; mCD206-PE (1:100, 141706, BioLegend, clone:C068C2), hCD206 (1:100, sc-376232, Santa Cruz, clone:C-10),hCD206-FITC(1:100, 321104, BioLegend, clone :15C2), iNOS (1:100, sc-7271, Santa Cruz, clone : C-11), TNF-α (1:100, sc-52746, Santa Cruz, clone : C-4), Icam1 (1 : 100, sc-8439, Santa Cruz, clone : G-5), p-Smad3 (coupe de paraffine, 1:100, sc-517575, Santa Cruz, clone : 1D9), CD16b-PE (1:100, 550868, BD Biosciences, clone:CLB-gran11.5), Ly6G-FITC (1:100, 127606, BioLegend, clone:1A8), Ly6G-PE (1:100, 127608, BioLegend, clone:1A8), Ly6G-APC (1 :100, 127614, BioLegend, clone : 1A8), p-Smad3 (1:200, 600-401-919, Rockland, polyclonal), CD11b-APC (1:100, 553311, BD Biosciences, clone : M1/70 ( RUO)). CD68-APC (1:100, 333810, BioLegend, clone : Y1/82 A). Les anticorps utilisés pour le test ChIP comprenaient anti-Smad3 (1:100, 9523 S, Cell Signaling Technology, clone: ​​C67H9) et IgG Isotype Control (1:1000, 3900S, Cell Signaling Technology, clone: ​​DA1E).

Les anticorps secondaires conjugués au polymère et au HRP utilisés comprenaient EnVision + system-HRp-labeled Polymer Anti-mouse (100 µL per section, K4003, Dako), EnVision + system-HRp-labeled polymer anti-rabbit (100 µL per section, K4003, Dako), anticorps secondaire de chèvre anti-Rat IgG (H + L), HRP (1:200,31470, Thermo fisher). Les anticorps secondaires conjugués Alexa Fluor utilisés comprenaient l'anticorps secondaire à adsorption croisée anti-IgG de souris (H + L), Alexa Fluor™ 488 (A-11001, Invitrogen), l'anticorps secondaire à adsorption croisée anti-souris de chèvre (H + L) Anticorps, Alexa Fluor™ 546(A-11035, Invitrogen), Chèvre anti-Lapin IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 546(A-11035, Invitrogen), Chèvre anti-Lapin IgG (H + L) + L) Anticorps secondaire hautement adsorbé, Alexa Fluor™ Plus 647(A32733, Invitrogen), IgG de chèvre anti-souris (H + L) Anticorps secondaire hautement adsorbé, Alexa Fluor™ Plus 647(A32728, Invitrogen)

Des coupes en paraffine d'adénocarcinome pulmonaire et de parenchyme pulmonaire macroscopiquement normal à au moins 5 cm de la tumeur chez le même patient ont été prélevées à l'hôpital Prince of Wales, Université chinoise de Hong Kong, Hong Kong. Les buffy coats humains sains ont été fournis par le service de transfusion sanguine de la Croix-Rouge de Hong Kong. L'étude a été menée selon les principes de la Déclaration d'Helsinki. Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les patients et donneurs de buffy coat. Cette étude a été approuvée par le comité d'éthique de la recherche clinique du groupe mixte de l'Université chinoise de Hong Kong et des nouveaux territoires (CREC Réf. : 2018.054).

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité d'éthique de l'expérimentation animale de l'Université chinoise de Hong Kong (CUHK) (numéro de référence AEEC : 18/005/GRF) et ont été réalisées conformément au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. . Toutes les souris ont été gardées par le Laboratory Animal Service Center de CUHK et maintenues à 22–23 ° C, <70% d'humidité relative avec un cycle alterné lumière / obscurité de 12 h avec un accès libre à l'alimentation et à l'eau standard de la souris. Souris Smad3 de type sauvage (Smad3-WT), déficientes en Smad3 (Smad3-KO) sur fond C57BL/6 J (les deux sexes, âgées de 8 à 12 semaines) et souris NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (souris NSG, mâle , âgés de 8 à 10 semaines) ont été utilisés dans cette étude. Les souris Smad3-KO (exon 8 supprimé et exon 7 interrompu) ont été gracieusement fournies par le Dr Chuxia Deng50. Les souris NSG ont été achetées au CUHK Laboratory Animal Services Centre. Des tumeurs LLC syngéniques ont été induites par injection sous-cutanée de 2 × 106 cellules LLC dans les flancs droits de souris Smad3-WT et Smad3-KO, comme décrit dans notre étude précédente17. Le modèle de xénogreffe de cancer du poumon humain A549 a été induit par injection sous-cutanée de 2 × 106 cellules A549 dans les flancs droits de souris NSG, comme indiqué précédemment17. La taille maximale de la tumeur de 2000 mm3 a été autorisée par l'AEEC. Dans certains cas, cette limite a été dépassée au dernier jour de mesure et les souris ont été immédiatement euthanasiées.

Des cellules de carcinome pulmonaire de Lewis LLC (CRL-1642, ATCC) ont été cultivées dans le milieu F-12 de milieu d'aigle modifié/mélange de nutriments de Dulbecco (DMEM/F12) avec 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (FBS) (Gibco), 100 U/ ml de pénicilline G et 100 mg/ml de streptomycine. Des cellules de carcinome pulmonaire humain A549 (CCL-185, ATCC) ont été cultivées dans du milieu Roswell Park Memorial Institute1640 (RPMI 1640) avec 5 % de FBS inactivé par la chaleur (Gibco), 100 U/ml de pénicilline G et 100 mg/ml de streptomycine. Le milieu conditionné des cellules cancéreuses a été recueilli après une incubation d'une nuit de cellules LLC avec du DMEM/F12 sans sérum (LLC-CM) ou des cellules A549 avec du RPMI 1640 sans sérum (A549 CM), suivi d'une filtration avec des membranes en nylon de 0,2 μm.

Des coupes de tissus inclus en paraffine (FFPE) et de microréseaux tumoraux (TMA) fixés au formol (5 µm d'épaisseur) ont été déparaffinées dans du xylène et réhydratées dans des alcools descendants, suivies d'un blocage de la peroxydase endogène dans une solution de peroxyde d'hydrogène à 3 % (30 min) et de la chaleur -récupération d'épitope induite dans un tampon citrate (95 ° C, 5 min). Les sections ont été incubées avec CD206 (1:100, clone : C-10, Santa Cruz), iNOS (1:100, clone : C-11, Santa Cruz), CD16b (1:100, clone : CLB-gran11.5, BD Biosciences), Ly6G (1:100, Clone : 1A8, BioLegend), p-Smad3 (1:100, Clone : 1D9, Santa Cruz), p-Smad3 (1:200, 600-401-919, Rockland) anticorps pendant une nuit (4 ° C), les coupes ont été incubées dans un anticorps secondaire conjugué au polymère-HRP (Dako) pendant 2 h à température ambiante, suivi de DAB (Thermo-fisher) ou de colorant Opal-520, 570, 650, 690 TSA (Akoya biosciences ) développement. Les images de section colorées au DAB ont été capturées par le microscope optique Nikon Ni-U et analysées à l'aide du logiciel d'analyse Image J; Les sections colorées par Opal TSA ont été capturées sur le poste de travail de pathologie quantitative Mantra (Akoya Biosciences) et analysées par le logiciel d'analyse d'images inForm 2.6 (Akoya Biosciences) conformément à nos études précédentes18,51.

Des échantillons de tissus d'archives fixés au formol inclus en paraffine (FFPE) ont été récupérés chez 72 patients atteints d'adénocarcinome pulmonaire (LUAD) avec des données démographiques complètes sur les patients (hommes et femmes compris, âgés de 37 à 85 ans) qui ont subi une intervention chirurgicale à l'hôpital Prince of Wales, Hong RAS de Kong. Les données sont présentées sous forme de fréquence (%) avec une analyse utilisant le coefficient de corrélation de Spearman. iNOS+CD16b+ et CD206+CD16b+ ont été définis comme les phénotypes N1 et N2, respectivement36. L'analyse de Kaplan-Meier et le test du log-rank ont ​​été utilisés pour évaluer la différence de survie des patients stratifiés en différents groupes en fonction de la fréquence des TAN N1 en proportion des TAN totaux. La détermination des seuils de TAN haut et bas de N1 était basée sur des valeurs médianes. Les informations cliniques et la quantification relative des marqueurs des matrices de tissus sont répertoriées dans les données supplémentaires 1.

Des sections de tissus tumoraux congelés intégrés à la température de coupe optimale (5 µm) ont été incubées avec des anticorps CD206, iNOS, Ly6G et p-Smad3 pendant une nuit à 4 ° C, suivies d'une incubation avec des anticorps secondaires conjugués à Alexa Fluor 546 ou Alexa Four 488 (1:1 000 ; Invitrogen) dans un tampon de coloration (eBioscience) pendant 2 h à température ambiante. Après lavage avec du PBS, les sections ont été colorées avec du Ly6G conjugué au FITC ou du CD16b conjugué au PE pendant une nuit à 4 ° C. Les noyaux ont été colorés avec du Hoechst 33342 (Invitrogen) pendant 5 min dans du PBS, puis montés avec du milieu PermaFluor (Thermo Fisher Scientific)52. Les images et le balayage de la pile z ont été acquis par les microscopes à fluorescence Zeiss Axio Observer.Z1 et LSM 880, respectivement, et analysés avec le logiciel d'analyse d'images ZEN lite 2.4.

Les tissus isolés de souris porteuses de tumeurs ont été mécaniquement dissociés, digérés par Liberase ™ TM (Roche), filtrés à travers un filet en nylon de 40 μm et fixés avec un tampon de fixation IC (eBioscience) selon le protocole du fabricant pour préparer des suspensions unicellulaires. Les neutrophiles ont été colorés avec les anticorps Ly6G, CD11b, iNOS et CD206 pendant une nuit à 4 ° C. Les données de cytométrie en flux ont été acquises sur LSRFortessa (Becton Dickinson) et analysées avec la plateforme Cytobank (cytobank.org) pour une analyse quantitative.

Les tumeurs pulmonaires des souris inoculées LLC (souris Smad3-WT et KO, 8 tumeurs / groupe) ont été disséquées, digérées en une population unicellulaire, puis des cellules CD11b + Ly6G + isolées par FACS. Les cellules triées ont été encapsulées et la construction de la bibliothèque a été réalisée avec le contrôleur Chromium avec un kit d'expression 5 '(10x Genomics). Pour chaque groupe, huit échantillons de tumeurs ont été mélangés pour générer des gouttelettes unicellulaires. Les librairies ont été séquencées sur la plateforme Illumina NovaSeq 6000 (PE151bp, 660 M raw read). Le traitement, l'analyse et la visualisation des données ont été effectués dans le studio R (v1.3.1073) à l'aide de Seurat (v4.1.1). Pour le contrôle de la qualité, les cellules avec au moins 200 gènes détectés ont été sélectionnées pour analyse, avec le pourcentage de lectures dérivées des mitochondries fixé à moins de 10 %, et le nombre total de molécules dans chaque cellule a été filtré par 500

Nous avons utilisé le package MetaCell pour sélectionner des gènes caractéristiques liés au développement des neutrophiles26, construire des amas de cellules le long de gradients de transcription (appelés métacellules) et visualiser et reconstruire un graphique k-NN (Fig. 4D) basé sur les données t-SNE de la Fig. 3A25. Les cellules qui contenaient moins de 500 UMI ou avaient une fraction de transcrit mitochondrial > 0,2 ont été retirées. Ensuite, des gènes variables dans l'ensemble de données ont été identifiés avec un seuil de variance/moyenne normalisé à 0,1 et un seuil de couverture sous-échantillonné à 80, produisant des gènes ont ensuite été utilisés comme ancres pour rechercher des corrélations gène-gène dans l'ensemble de données, et des gènes avec des corrélations de> 0,1 ont été inclus.

L'ensemble de données public sur le cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC) scRNA-seq des cellules tumorales de sept donneurs avec une description complète de la collecte d'échantillons, de la préparation de la bibliothèque et de la configuration de séquençage est accessible sur le site Web de 10x Genomics via l'URL suivante : https : //www.10xgenomics.com/resources/datasets/40-k-mixture-of-nsclc-dt-cs-from-7-donors-3-ht-v-3-1-3-1-high-6- 1-0. Le clustering of Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) a été effectué par le pipeline Cell Ranger avec des paramètres par défaut55. Les neutrophiles ont été extraits de l'ensemble de données NSCLC par le logiciel Loupe Cell Browser 6.0 suivant le protocole du site Web 10x Genomics via l'URL suivante : https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/tutorials /neutrophiles. Les TAN SMAD3 + et SMAD3- ont été regroupés par réduction de dimensionnalité avec UMAP et expression de gènes marqueurs de neutrophiles (CSF3R, FPR1, NAMPT, MNDA et FCGR3B) (Fig. 7 supplémentaire).

L'analyse de la vitesse de l'ARN a été effectuée par scVelo pour déduire les états futurs des cellules individuelles en utilisant les informations épissées et non épissées comme décrit dans les études précédentes18,56. Le fichier bam aligné généré par Cell Ranger a été recompté avec le pipeline de comptage Velocyto velocyto.py en python. Le code complet et les cahiers de Velocyto et scVelo utilisés sont disponibles sur http://velocyto.org. et https://scvelo.readthedocs.io. Les comptages par échantillon des lectures non épissées et épissées au format métier à tisser ont été chargés sur scVelo. Les gènes avec moins de 20 comptes épissés et non épissés dans une cellule ont été filtrés et les comptes ont été normalisés à l'aide de normalize_per_cell. Un total de 2000 gènes à forte variabilité ont été identifiés et retenus par filter_genes_dispersion, après quoi les comptes ont été transformés en log à l'aide de log1p. Les moments de premier et de second ordre pour chaque cellule sur ses voisins les plus proches ont été calculés à l'aide de scvelo.pp.moments. Par la suite, les vitesses ont été estimées à l'aide de scvelo.tl.velocity et du graphique de vitesse construit à l'aide de la fonction scvelo.tl.velocity_graph. Les vitesses ont été visualisées au-dessus de l'espace UMAP de diffusion. Les valeurs de confiance de la vitesse de l'ARN ont été calculées avec la fonction scVelo.tl.velocity_confidence. Les trajectoires de développement des TAN Smad3-WT et Smad3-KO ont été reconstruites à l'aide du package Monocle ; Les phénotypes N1 (Tnf+) et N2 (Ccl2+) ont été annotés selon l'expression de Tnf et Ccl2, respectivement.

La moelle osseuse du tibia, du fémur et de l'ilium a été prélevée sur des souris porteuses de tumeurs LLC, filtrée à l'aide d'un filet en nylon de 40 μm et décontaminée des érythrocytes pour préparer une suspension unicellulaire comme décrit dans notre étude précédente17. Les BMDN ont été isolés à l'aide du kit d'isolement des neutrophiles intacts (130-097-658, Miltenyi Biotec) conformément aux instructions du fabricant et maintenus avec le milieu de Dulbecco modifié d'Iscove (Gibco) complété avec 1 % de sérum de cheval (Rockland) et 10 ng/ml de granulocytes. facteur de stimulation des colonies de macrophages (GM-CSF) (Invitrogen).

Les PBDN ont été isolés à partir d'échantillons de buffy coat humain sain à l'aide du Whole Blood Neutrophil Isolation Kit (130-104-434, Miltenyi Biotec) conformément aux instructions du fabricant et conservés dans du RPMI 1640 (Gibco) additionné de 1 % de sérum de cheval (Rockland) et de 10 ng /ml de GM-CSF (Invitrogen).

L'anticorps anti-Ly6G (clone 1A8, #BE0075-1)28 (50 µg/souris) a été administré par injection intrapéritonéale à des souris Smad3-WT et Smad3-KO 3 jours avant l'inoculation sous-cutanée avec des cellules LLC, puis administré tous les jours jusqu'à ce que les animaux ont été tués. Le groupe témoin a reçu un anticorps témoin d'isotype IgG. La taille de la tumeur a été contrôlée avec un pied à coulisse tous les 2 jours tout au long du traitement.

Le BMDN isolé de donneurs Smad3-WT et Smad3-KO porteurs de tumeurs a été transféré de manière adoptive dans des souris C57BL/6 J porteuses de LLC. En bref, des BMDN Smad3-WT et Smad3-KO intacts (3 × 106 cellules/souris) ont été administrés à des souris receveuses par injection dans la veine caudale aux jours 15 et 20 après l'établissement de la tumeur LLC, et les souris ont été tuées au jour 25. le moment a été choisi car l'infiltration de neutrophiles dans le site inflammatoire est diminuée après 5 jours12. Les PBDN transfectés avec un siARN témoin non-sens brouillé (NC-PBDN) ou avec des siARN SMAD3 (S3KD-PBDN) ont été transférés de manière adoptive dans des souris NSG porteuses d'A549 via une perfusion de veine caudale aux jours 15 et 20 après l'établissement de la tumeur17. Le volume de la tumeur a été mesuré avec un pied à coulisse et calculé à l'aide de l'équation : Volume (mm3) = 0,5 (long × carré de petit diamètre).

Les BMDN intacts ont été isolés de souris Smad3-WT et Smad3-KO, puis marqués avec la solution CellTrace ™ CFSE (vert, Invitrogen) ou la solution de marquage cellulaire Vybrant ™ DiI (rouge, Invitrogen), respectivement, en suivant le protocole du fabricant. Un mélange 1: 1 de Smad3-WT-BMDN marqué par CFSE et de Smad3-KO-BMDN marqué par DiI a été injecté (3 × 106 cellules / souris) à des souris C57BL / 6 J le jour 15 après inoculation avec des cellules LLC. Les souris ont été tuées au jour 16 et les tumeurs ont été collectées.

Des BMDN Smad3-WT et Smad3-KO intacts ont été co-cultivés avec des cellules LLC à des rapports de 1: 5, 1: 10 et 1: 20 (LLC: BMDN) pendant 6 h. De plus, les PBDN traités par NC et siSMAD3 ont été co-cultivés avec des cellules A549 dans des rapports de 1: 2, 1: 5 et 1: 10 (A549: PBDN) pendant 6 h. Les surnageants ont ensuite été recueillis par centrifugation et analysés pour la libération de LDH à l'aide du test de cytotoxicité non radioactif CytoTox 96® (Promega) conformément aux instructions du fabricant.

Les cellules LLC (1 × 107) ont été incubées avec 50 μL de solution de marquage cellulaire Vybrant™ DiI (Invitrogen, 5 μg/μL dans de l'éthanol) pendant 20 min à 37 °C dans l'obscurité. Le colorant non lié a été éliminé par lavage au PBS et centrifugation à 500 x g pendant 5 min. Des BMDN Smad3-WT et Smad3-KO intacts ont été co-cultivés avec des cellules Dil-LLC à des rapports de 1: 5 et 1: 10 (LLC: BMDN) pendant 6 h. L'intensité fluorescente (excitation 583 nm et émission 475 nm) a été détectée par un spectrophotomètre (Molecular Devices)13. Les cellules LLC non colorées et les BMDN ont été inclus comme témoins négatifs.

Pour l'analyse cytométrique en flux liée au test de phagocytose57, les BMDN Smad3-WT et Smad3-KO intacts ont été co-cultivés avec des cellules Dil-LLC à des rapports de 1: 5 (LLC: BMDN) pendant 6 h. Les données de cytométrie en flux ont été acquises sur LSRFortessa (Becton Dickinson) et analysées avec la plateforme Cytobank (cytobank.org) pour une analyse quantitative.

Les cellules neutrophiles dérivées de la moelle osseuse extraites de souris Smad3-WT (regroupées à partir de quatre souris / groupe) ont été traitées avec 10 % de LLC-CM ou un milieu normal (contrôle) pendant 2 h, puis traitées à l'aide du kit SimpleChIP Enzymatic Chromatin IP (Cell Signaling Technology) selon les instructions du fabricant58. Des anticorps contre Smad3 et un contrôle d'isotype IgG (Cell Signaling Technology) ont été utilisés pour l'immunoprécipitation. L'ADN immuno-enrichi de Smad3 (entrée et Smad3-IP) a été séquencé à l'aide de la plate-forme Illumina HiSeq (PE150bp, lecture brute de 40 M), cartographié par rapport au génome de Mus musculus GRCm38 (mm10) à l'aide de Bowtie2, et les pics ont été identifiés à l'aide d'une analyse basée sur un modèle pour ChIP -Seq (MACS) avec les paramètres par défaut. Les régions de liaison Smad3 normalisées ont été visualisées par EaSeq59 et annotées par l'outil d'enrichissement des régions génomiques d'annotations (GREAT) pour l'analyse d'enrichissement DAVID-GO. L'analyse des motifs a été effectuée dans Trawler (trawler.erc.monash.edu.au) avec des paramètres par défaut.

L'ARN cellulaire total a été extrait à l'aide du réactif Trizol (Molecular Research Center), transcrit inversement et quantifié par PCR en temps réel à l'aide de SYBR Green Supermix (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) avec des amorces comme décrit précédemment dans les réf. 17,60. Les amorces utilisées sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 4. L'expression relative des gènes cibles a été normalisée par rapport au contrôle interne GAPDH et calculée par la méthode 2-ΔΔCt.

Les PBDN humains ont été récoltés et transfectés avec 100 nM d'un contrôle non-sens brouillé (siN05815122147, RIBOBIO) ou d'ARNsi contre SMAD3 (5′-AAGAGAUUCGAAUGACGGUAA-3′). L'efficacité de l'inactivation a été quantifiée par PCR en temps réel avec des amorces pour le SMAD3 et le GAPDH humains (voir le tableau supplémentaire 4).

Des souris Smad3-WT porteuses de tumeurs ont été divisées au hasard en quatre groupes le jour 7 après inoculation avec des cellules LLC. Les souris ont reçu 2, 5, 5 ou 10 μg / g de SIS3 (S7959, Selleckchem) par injection intrapéritonéale quotidienne du jour 7 jusqu'au jour 16 pour la récolte de la tumeur. Le groupe témoin a reçu le véhicule témoin (0,05 % de diméthylsulfoxyde)17. La taille de la tumeur a été contrôlée avec un pied à coulisse Vernier. Pour les expériences in vitro, les cellules BMDN ont été prétraitées avec ou sans SIS3 (2 μM/mL) pendant 2 h puis stimulées avec LLC-CM pendant 24 h.

Le test t de l'étudiant bilatéral et l'analyse de la variance avec la correction de Bonferroni ont été utilisés pour l'analyse statistique des différences dans les niveaux d'expression de l'ARNm, le poids et la croissance de la tumeur, l'infiltration des neutrophiles, la viabilité, la cytotoxicité et la phagocytose, l'analyse par cytométrie en flux, la quantification IHC et IF en utilisant le programme Prism (Prism 5.0, 9.0 GraphPad Software, San Diego, CA). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. L'analyse de corrélation de Spearman et le test du log-rank ont ​​été utilisés pour analyser les données de la cohorte NSCLC. La valeur P < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les ensembles de données brutes d'ARN-seq et ChIP-seq sont disponibles dans la base de données Gene Expression Omnibus et ArrayExpress sous les numéros d'accession GSE186530 et E-MTAB-12740, respectivement. Les données publiquement disponibles sur le NSCLC humain utilisées dans cette étude sont disponibles dans la base de données génomique 10X [https://www.10xgenomics.com/resources/datasets/40-k-mixture-of-nsclc-dt-cs-from-7- donneurs-3-ht-v-3-1-3-1-élevé-6-1-0]. Les autres données sont disponibles dans le fichier Article, Informations supplémentaires ou Données source. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Cette étude a été soutenue par le Research Grants Council de Hong Kong (RGC 14106518, 14111019 et 14111720); Programme de bourses postdoctorales RGC (PDFS2122-4S06); Fonds pour la santé et la recherche médicale 10210726 ; Prix ​​​​de l'innovation de la faculté de l'Université chinoise de Hong Kong (4620528), subvention directe pour la recherche (4054510 et 4054668), programme de bourses postdoctorales 2021-22 (NL / LT / PDFS2022 / 0360 / 22lt) et CU Medicine Passion for Perfection Scheme PFP202210-004 . Nous remercions le Dr Chuxia Deng pour les souris Smad3-WT/KO. Les biopsies et les données cliniques du NSCLC ont été recueillies par Joanna HM Tong. Le Dr Rainbow WH Lau du Département de chirurgie a fourni des biopsies fraîches et un soutien technique du Core Utilities of Cancer Genomics and Pathobiology de l'Université chinoise de Hong Kong.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Jeff Yat-Fai Chung, Philip Chiu-Tsun Tang, Max Kam-Kwan Chan, Patrick Ming-Kuen Tang.

Département de pathologie anatomique et cellulaire, State Key Laboratory of Translational Oncology, Université chinoise de Hong Kong, Shatin, Hong Kong

Jeff Yat-Fai Chung, Philip Chiu-Tsun Tang, Max Kam-Kwan Chan, Vivian Weiwen Xue, Ka-Fai To et Patrick Ming-Kuen Tang

Laboratoire clé provincial du Guangdong sur l'immunité et les maladies régionales, Carson International Cancer Center, Département de pharmacologie, Centre des sciences de la santé de l'Université de Shenzhen, Shenzhen, Chine

Vivian Weiwen Xue

Département de médecine et de thérapeutique, Institut des sciences de la santé Li Ka Shing, Université chinoise de Hong Kong, Shatin, Hong Kong

Xiao-Ru Huang et Hui-Yao Lan

Département de chirurgie, Université chinoise de Hong Kong, Shatin, Hong Kong

Calvin Sze-Hang Ng

Collège de pharmacie, Université de Jinan, Guangzhou, Chine

Dongmei Zhang

Département de pédiatrie, Université chinoise de Hong Kong, Shatin, Hong Kong

Kam-Tong Leung

Département de pathologie chimique, Université chinoise de Hong Kong, Shatin, Hong Kong

Chun-Kwok Wong

Programme de reproduction, de développement et d'endocrinologie, École des sciences biomédicales, Université chinoise de Hong Kong, Shatin, Hong Kong

Tin-Lap Lee

Sun Yat-sen University Cancer Center, State Key Laboratory of Oncology in South China, Collaborative Innovation Center for Cancer Medicine, Guangdong, 510060, Chine

Eric WF Lam

Département de néphrologie et département de médecine de l'Université Monash, Monash Medical Center, Clayton, VIC, 3168, Australie

David J. Nikolic-Paterson

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PM-KT est le chercheur principal qui a découvert le rôle de Smad3 dans la polarisation N1/N2 de TAN, conçu et mené des expériences et supervisé la préparation et la révision du manuscrit. JY-FC et PC-TT ont réalisé des expériences, analysé des données et révisé le manuscrit. MK-KC a effectué la programmation avancée et l'analyse bioinformatique. VWX a conduit et T.-LL a conseillé le 10X scRNA-seq. CS-HN, CK.W. et KF.T. ont fourni des échantillons cliniques, des couches leucocytaires et des données sur les patients. EW-FL, K.-TL, DZ et DJN-P. édité le manuscrit. XR.H. souris Smad3-KO préparées. HY.L. soutenu l'étude. DJN-P. réorganisé le manuscrit et conseillé la révision.

Correspondance à Patrick Ming-Kuen Tang.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Zvi Fridlender, Lei Zhang et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Chung, J.YF., Tang, PCT., Chan, M.KK. et coll. Smad3 est essentiel pour la polarisation des neutrophiles associés à la tumeur dans le carcinome pulmonaire non à petites cellules. Nat Commun 14, 1794 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37515-8

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Reçu : 05 octobre 2020

Accepté : 20 mars 2023

Publié: 31 mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-37515-8

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