Les enzymes de désubiquitination et le protéasome régulent des ensembles préférentiels de substrats d'ubiquitine

Oct 18, 2023

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 2736 (2022) Citer cet article

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L'axe ubiquitine-protéasome a été largement exploré à l'échelle du système, mais l'impact des enzymes de désubiquitination (DUB) sur l'ubiquitinome reste largement inconnu. Ici, nous comparons les contributions du protéasome et des DUB sur l'ubiquitinome global, en utilisant la technologie UbiSite, les inhibiteurs et la spectrométrie de masse. Nous découvrons de grands réseaux dynamiques de signalisation de l'ubiquitine avec des substrats et des sites préférentiellement régulés par les DUB ou par le protéasome, mettant en évidence le rôle des DUB dans l'ubiquitination indépendante de la dégradation. Les DUB régulent les substrats via au moins 40 000 sites uniques. Des réseaux régulés de substrats d'ubiquitine sont impliqués dans l'autophagie, l'apoptose, l'intégrité du génome, l'intégrité des télomères, la progression du cycle cellulaire, la fonction mitochondriale, le transport des vésicules, la transduction du signal, la transcription, l'épissage du pré-ARNm et de nombreux autres processus cellulaires. De plus, nous montrons que l'ubiquitine conjuguée à SUMO2/3 forme un fort signal de dégradation du protéasome. Fait intéressant, PARP1 est hyper-ubiquitinée en réponse à l'inhibition DUB, ce qui augmente son activité enzymatique. Notre étude révèle les rôles régulateurs clés des DUB et fournit une ressource de sites d'ubiquitination endogènes pour faciliter l'analyse de la signalisation de l'ubiquitine spécifique au substrat.

La conjugaison covalente et réversible de l'ubiquitine (Ub) marque souvent ses protéines cibles pour la dégradation via le protéasome, mais peut également modifier leur localisation subcellulaire, affecter leur activité et favoriser ou empêcher les interactions protéiques1,2. L'ubiquitination commence par le couplage de Ub à l'une des deux enzymes activant l'ubiquitine (E1s ; UBA1 et UBA6). Ub est ensuite transféré à l'une des ~35 enzymes de conjugaison de l'ubiquitine (E2) par trans-thiolation3. L'E2 a des sites de liaison structurellement conservés pour une ou plusieurs des ligases 600-700 Ub (E3), qui transmettent la spécificité du substrat d'ubiquitine3. Ub peut être modifié sur les sept lysines internes (K6, K11, K27, K29, K33, K48 et K63) et via une liaison tête-bêche (M1), donnant naissance à des chaînes Ub. Le réseau de signalisation complexe d'Ub est régulé par des enzymes de désubiquitination (DUB), qui peuvent éliminer Ub des protéines cibles et désassembler les polymères Ub. Les quelque 100 DUB humains putatifs sont séparés en deux classes principales, les protéases à cystéine et les métalloprotéases. Les protéases à cystéine sont subdivisées en six familles, les protéases spécifiques à l'ubiquitine (USP), les hydrolases Ub C-terminales (UCH), les protéases à domaine Machado-Josephin (MJD), les protéases de tumeur ovarienne (OTU), le motif interagissant avec la nouvelle famille DUB contenant Ub (MINDY) et Zn-finger and UFSP domain protein (ZUFSP)4.

Les niveaux cellulaires à l'état d'équilibre de chaque protéine résultent de la vitesse de sa synthèse et de la vitesse de sa dégradation sélective5. La régulation de l'homéostasie des protéines cellulaires par dégradation via le système Ub-protéasome (UPS) rivalise avec la régulation via la transcription et la traduction en termes d'importance. Le tétraUb canonique lié à K48 sert de signal de dégradation efficace6. La grande majorité des protéines mal repliées nécessitent des chaînes Ub liées à K48 pour une dégradation efficace7. Cependant, les chaînes Ub liées à K48 peuvent également avoir des fonctions indépendantes de la dégradation, et des polymères Ub alternatifs peuvent également fonctionner comme des signaux de dégradation in vitro8,9,10,11. Par exemple, la cycline B est ciblée pour la dégradation par plusieurs chaînes Ub courtes de divers types de liaison12 et les chaînes liées à K48 et K63 servent toutes deux de signaux de dégradation protéasomiques efficaces lorsqu'elles sont conjuguées à la troponine13. Récemment, il a été montré que 10 à 20 % des chaînes Ub sont ramifiées14. Les chaînes d'Ub ramifiées K11/K48 améliorent la dégradation des substrats dans les cellules15, tandis que les types complexes d'Ub ramifiée peuvent réduire l'efficacité de la dégradation13. Fait intéressant, une fraction considérable de la signalisation Ub est indépendante du protéasome16,17,18,19. Par exemple, la mono-ubiquitination des histones H2A K119 et H2B K120 régule l'organisation et la transcription de la chromatine19. La modification de résidus lysine spécifiques suggère une localisation préférentielle de Ub sur ces substrats. L'ubiquitination spécifique au site des substrats a récemment été examinée ailleurs20,21.

Des améliorations substantielles ont été apportées aux méthodes de purification des substrats d'Ub depuis la découverte de 110 peptides modifiés diGly correspondant au fragment trypsique d'Ub22. Depuis lors, des anticorps spécifiques de diGly ont permis la purification de dizaines de milliers de peptides modifiés par Ub18,23,24,25,26,27. Cependant, les modificateurs apparentés de type Ub (Ubl) NEDD8 et ISG15 partagent ce résidu diGly. Pour surmonter ce défi, un anticorps reconnaissant le fragment Lys-C de Ub (UbiSite) a été récemment développé, garantissant que la modification correspond à une modification de Ub plutôt qu'à NEDD8 ou ISG1528.

Ici, nous découvrons de grands réseaux de signalisation Ub dynamiques différentiels où les substrats et les sites sont préférentiellement régulés par les DUB ou par le protéasome, mettant en évidence les rôles des DUB dans la signalisation Ub indépendante de la dégradation. Nous constatons que PARP1, un composant clé des voies de réponse aux dommages à l'ADN, est hyper-ubiquitinée en réponse à l'inhibition DUB, ce qui augmente son activité enzymatique.

Pour explorer les contributions relatives du protéasome et des DUB à la dynamique de l'ubiquitine cellulaire à l'échelle du protéome, nous avons utilisé trois inhibiteurs du système UPS et deux méthodes de purification Ub distinctes pour les écrans de spectrométrie de masse (MS) à grande échelle. Nous avons inclus l'inhibiteur DUB PR619 qui inhibe les protéases à cystéine, mais pas les métalloprotéases, l'inhibiteur du protéasome MG132 et l'inhibiteur de l'Ub E1 TAK24329,30. Alors que MG132 bloquait efficacement l'activité du protéasome, TAK243 et PR619 avaient un effet minimal comme prévu (Fig. 1a supplémentaire) tandis que WIN 62 577, un antagoniste non peptidique du récepteur de la tachykinine NK1, était utilisé comme contrôle positif et augmentait également l'activité du protéasome comme prévu31. Le mécanisme précis derrière l'activation du protéasome de ce composé n'est pas clair.

Un criblage MS a été réalisé à l'aide d'une lignée cellulaire U2OS exprimant de faibles niveaux d'Ub marqué par His10 (Fig. 1a), et un deuxième criblage MS a été réalisé à l'aide de la technologie UbiSite pour l'enrichissement spécifique au site des sites Ub endogènes des cellules U2OS (Fig. 1b). Les substrats His10-Ub ont été purifiés à partir d'U2OS et traités avec les inhibiteurs pendant 10, 30, 60 ou 180 min. Les substrats Ub se sont accumulés lors du traitement avec l'inhibiteur de protéasome MG132 (Fig. 1c) et lors du traitement avec l'inhibiteur DUB PR619 (Fig. 1d). La majeure partie des conjugués Ub a été traitée par les DUB et le protéasome en 3 h, comme le montre la disparition des conjugués Ub après 3 h de traitement par TAK243 dans les cellules U2OS His10-Ub (Fig. 1e). De manière cohérente, ces résultats ont été récapitulés dans les cellules U2OS parentales utilisées comme témoins pour les pulldowns His10-Ub (Fig. 1f) et dans les échantillons d'entrée UbiSite (Fig. 1g). Par la suite, nous avons utilisé des traitements combinés avec l'inhibiteur d'Ub E1 TAK243 pour déterminer le temps nécessaire aux DUB et au protéasome pour retourner la majeure partie des conjugués d'Ub présents à un moment donné, sans interférence par de nouveaux événements d'ubiquitination. Un traitement combiné avec TAK243 et MG132 pendant 1 h a entraîné une déplétion des conjugués Ub (Fig. 1h), tandis qu'un traitement combiné avec TAK243 et PR619 pendant 1 h a entraîné une réduction des conjugués Ub et une réduction supplémentaire au bout de 3 h (Fig. 1i), indiquant une cinétique rapide pour l'élimination de l'Ub médiée par DUB des substrats. Ces résultats soulignent les principales contributions des DUB et du protéasome à la dynamique Ub. Plus de substrats Ub se sont accumulés lors du traitement combiné avec PR619 et MG132 par rapport aux traitements uniques comme prévu (Fig. 1j).

a Aperçu graphique de la méthodologie utilisée pour l'évolution temporelle de l'inhibiteur UPS et la purification des substrats Ub marqués His10 par des billes Ni-NTA, la digestion trypsique et l'identification MS. b Aperçu graphique de la méthodologie utilisée pour les traitements aux inhibiteurs de l'UPS et la purification des sites Ub endogènes par IP du fragment Lys-C de l'Ub, digestion trypsique, fractionnement et identification MS. c–e Ponceau S et coloration immunoblot avec anti-Ub (P4D1) d'échantillons d'entrée de U2OS-His10-Ub traités avec un inhibiteur du protéasome (10 µM MG132) (c), un inhibiteur DUB (20 µM PR619) (d) ou Ub Inhibiteur E1 (1 µM TAK243) (e) pour les points de temps indiqués, n = 3 échantillons biologiquement indépendants. f Échantillons d'entrée de cellules parentales U2OS traitées avec des inhibiteurs UPS pendant 3 h, colorées avec anti-Ub (P4D1), n ​​= 3 échantillons biologiquement indépendants. g Répliques d'échantillons d'entrée U2OS traités avec des inhibiteurs UPS pendant 3 h et utilisés pour la purification de sites Ub endogènes, colorés avec anti-Ub (P4D1), n ​​= 3 échantillons biologiques indépendants. h–j Échantillons d'entrée de U2OS-His10-Ub traités avec des traitements combinés inhibiteur d'Ub E1 et inhibiteur de protéasome (h), inhibiteur d'Ub E1 et inhibiteur de DUB (i) ou inhibiteur de protéasome et inhibiteur de DUB (j) avec coloration anti-Ub (P4D1 ), n = 4 échantillons biologiquement indépendants. k Quantification de l'intensité du frottis Ub immunoblot (P4D1) ajustée en fonction de l'intensité de la β-actine (A5441) (Fig. 2 supplémentaire). Les données représentent le % d'intensité moyenne des contrôles DMSO (points temporels 10, 30, 60 et 180 min), les moustaches représentent la SD et les cercles indiquent chaque valeur individuelle. La plage de concentration d'inhibiteur a été sélectionnée sur la base d'une utilisation courante sur le terrain pour les inhibiteurs du protéasome MG132, Bortezomib, Carfilzomib et l'inhibiteur DUB PR619, n = 3 échantillons biologiquement indépendants. I Substrats His10-Ub purifiés avec des billes Ni-NTA provenant de cellules traitées pendant 3 h avec un ou des inhibiteur(s) UPS, colorées pour Ub (P4D1), n ​​= 3 échantillons biologiquement indépendants. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Étant donné qu'une certaine variation a été observée dans les niveaux d'intensité totale du frottis Ub suite à l'inhibition du DMSO, du DUB ou du protéasome, nous avons effectué une titration de dose avec les inhibiteurs du protéasome MG132, Bortezomib et Carfilzomib et l'inhibiteur DUB PR619 à des concentrations de médicament pertinentes à 10, 30, 60 et 180 minutes (Fig. 1k). Nous avons quantifié l'intensité du frottis Ub et corrigé en fonction de l'intensité de la β-actine témoin de charge, et les résultats sont visualisés en pourcentage de l'intensité moyenne du DMSO (10, 30, 60 et 180 min) (Fig. 2 supplémentaire ). Dans ce cas, nous avons constaté par immunotransfert que le signal Ub était comparable entre les échantillons de cellules traitées avec DUB ou des inhibiteurs du protéasome, ce qui était dépendant de la concentration. Cependant, nous soupçonnons que le PR619 est sujet aux effets de lot, le lot de PR619 utilisé pour ces expériences étant moins actif par rapport aux lots utilisés pour nos autres expériences, sous-estimant ainsi peut-être l'effet PR619 dans ce cas.

Les substrats Ub ont été efficacement enrichis par un pulldown de billes Ni-NTA avec épuisement des substrats Ub détectables par immunotransfert dans des cellules traitées par TAK243 (Fig. 1l). Les mêmes échantillons ont également été sondés pour les chaînes Ub liées à K48 et K63 et nous avons observé un enrichissement des chaînes liées à K48 dans les échantillons traités au MG132, en accord avec les données publiées précédemment (Fig. 1b supplémentaire). Les chaînes Ub liées à K48 et K63 se sont accumulées dans les cellules traitées avec PR619 tandis que le traitement TAK243 a épuisé les deux types de chaînes (Fig. 1b, c supplémentaires). De plus, nous avons sondé les conjugués SUMO2/3 dans les mêmes échantillons enrichis en Ub et observé une augmentation des protéines SUMOylées dans les échantillons traités au TAK243, à la fois au niveau de l'entrée et dans les échantillons enrichis en Ub comme prévu32. Les protéines SUMOylées se sont également accumulées dans les échantillons d'entrée et enrichis en Ub lors du traitement par MG132 et PR619, indiquant des chaînes mixtes ou des substrats à double modification comme prévu33 (Fig. 1d supplémentaire). En parallèle, nous avons purifié les sites Ub endogènes de cellules U2OS traitées pendant 3 h avec du DMSO, du TAK243, du MG132 ou du PR619 en utilisant l'anticorps UbiSite (Fig. 1b). Les échantillons d'entrée de chaque répétition ont été testés par immunotransfert et nous avons observé des effets reproductibles et cohérents sur les substrats Ub entre les répétitions (Fig. 1g).

Ensuite, nous avons analysé nos échantillons par MS et identifié 2 804 protéines ubiquitinées dans les fractions purifiées His10-Ub après filtrage des données comme décrit dans les matériaux et méthodes, et 55 355 sites Ub sur un total de 9267 protéines par MS en utilisant l'approche UbiSite (Fig. 2a , b)28. L'intensité de 42 % des substrats His10-Ub identifiés et de 77 % des sites Ub identifiés a changé de manière significative en réponse aux traitements (test t de Student bilatéral vs DMSO, FDR = 0, 05, S0 = 0, 1, Fig. 2c, d). Parmi les traitements, le PR619 et les combinaisons comprenant le PR619 ont eu l'effet le plus dynamique sur les substrats His10-Ub (Fig. 2e). De plus, la grande majorité des sites Ub ont changé de manière significative en réponse aux traitements TAK243 et PR619 avec une dynamique considérablement moindre observée pour le traitement MG132 (Fig. 2f). La distribution et le chevauchement des sites Ub identifiés dans au moins un réplicat par groupe de traitement ont été visualisés dans un diagramme de Venn, qui affichait une grande partie des sites exclusivement identifiés dans des échantillons de cellules traitées avec PR619 ou MG132 (Fig. 2g).

a Les substrats His10-Ub identifiés purifiés à partir de cellules traitées pendant 3 h avec les inhibiteurs de l'UPS indiqués après avoir éliminé les protéines identifiées dans les échantillons U2OS parentaux ont été filtrés (tous les traitements) (valeur p du test t de l'étudiant droit = ​​0,05, S0 = 0,1), n = 3 échantillons biologiquement indépendants. Chaque point de données est représenté par un cercle coloré ; la case contient le 25–75e centile et la ligne orange indique la moyenne et les barres d'erreur représentent l'écart-type. b Sites Ub identifiés purifiés avec l'anticorps UbiSite à partir de cellules U2OS traitées avec les inhibiteurs UPS indiqués pendant 3 h, n = 3 échantillons biologiquement indépendants. Chaque point de données est représenté par un cercle coloré, la case contient le 25-75e centile et la ligne orange indique la moyenne et les barres d'erreur représentent l'écart-type. c Pourcentage de protéines dans les échantillons His10-Ub qui ont changé de manière significative dans l'un des traitements inhibiteurs de l'UPS et les points de temps par rapport au contrôle DMSO (test t de Student FDR = 0,05, S0 = 0,1). d Pourcentage de sites Ub qui ont changé de manière significative dans l'un des traitements inhibiteurs de l'UPS par rapport au contrôle DMSO (test t de Student FDR = 0,05, S0 = 0,1). e, f Pourcentage de protéines significativement altérées en réponse au traitement indiqué aux moments indiqués dans les échantillons His10-Ub (e) et les sites Ub à 3 h (f). g Diagramme de Venn des sites Ub identifiés par traitement à partir des données UbiSite DDA, où les sites identifiés dans au moins une répétition dans plusieurs traitements ont été considérés comme des intersections. h Histogramme du nombre de sites Ub identifiés par protéine. i Nuage de points du nombre de sites Ub par rapport au poids moléculaire de la protéine, avec analyse de corrélation de Pearson. j Traitements inhibiteurs d'UPS, et combinaisons d'inhibiteurs d'UPS avec ou sans ajout de 50 µg/ml d'inhibiteur de traduction Cycloheximide (CHX) à 3 h ; les échantillons ont été immunotransférés pour Ub (P4D1), n ​​= 3 échantillons biologiquement indépendants. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Ensuite, nous avons déterminé le nombre de sites Ub par protéine et identifié AHNAK comme une valeur aberrante avec plus de deux fois plus de sites que toute autre protéine (Fig. 2h). La ligase E3 UBE3C cible AHNAK pour la dégradation protéasomique par ubiquitination, qui supprime l'inhibition de l'expression génique médiée par p53, entraînant une amélioration de la souche34. De plus, plusieurs sites Ub ont été découverts sur AHNAK exclusivement dans des échantillons inhibés par DUB (ensemble de données supplémentaire 4). Ensuite, nous avons vérifié si une grande taille de protéine était corrélée à l'abondance de sites Ub, mais nous avons trouvé une faible corrélation entre le poids moléculaire de la protéine et le nombre de sites Ub (corrélation de Pearson 0, 442) (Fig. 2i).

Il est connu que les protéines mal repliées nouvellement synthétisées sont ciblées pour la dégradation protéasomique par ubiquitination24,35,36. Par conséquent, nous avons utilisé l'inhibiteur de traduction cyclohexamide en combinaison avec des inhibiteurs de l'UPS. La rétention des substrats Ub après l'inhibition de Ub E1 et l'inhibition simultanée du protéasome dépendait de la traduction active, tandis que les substrats Ub qui restaient après l'inhibition de Ub E1 et DUB ne dépendaient pas de la traduction active (Fig. 2j). Cela indique que les DUB traitent des protéines vivantes plus longues, alors que le protéasome cible des protéines nouvellement traduites, probablement mal repliées.

Les substrats His10-Ub identifiés en réponse au traitement par PR619 ou MG132 ont été divisés en trois groupes chacun : "enrichi", "inchangé" et "appauvri" (Fig. 3a – c, g – i). Les groupes ont été étiquetés en fonction de leur profil de changement de pli par rapport au DMSO par point de temps dans DUB (Fig. 3a – c) ou des échantillons inhibés par le protéasome (Fig. 3g – i). Les substrats His10-Ub avec un enrichissement supérieur au double pendant au moins un point dans le temps ou un appauvrissement supérieur au double pendant au moins un point dans le temps ont été attribués aux groupes correspondants, à quelques rares exceptions près pour les deux groupes (<10 protéines). La plupart des protéines (67%) du groupe de substrats enrichis en réponse au traitement PR619 n'ont pas été identifiées en réponse au traitement MG132 (Fig. 3d). Les substrats His10-Ub enrichis en réponse au traitement au MG132 étaient soit enrichis (44%), non identifiés (30%) ou inchangés (24%) en réponse au traitement au PR619 (Fig. 3j). 44% des substrats His10-Ub exclusivement identifiés dans les traitements PR619 étaient enrichis par rapport au DMSO (Fig. 3m). De même, 56% des substrats His10-Ub exclusivement identifiés dans les traitements MG132 étaient enrichis par rapport au DMSO (Fig. 3n). Cependant, l'enrichissement des substrats exclusivement identifiés en réponse à l'un ou l'autre des traitements pourrait s'expliquer en partie par des événements d'imputation de protéines non identifiées dans les échantillons de DMSO.

a–c Dynamique des substrats His10-Ub identifiés dans les échantillons traités au PR619 regroupés en fonction de leur facteur de variation par rapport au DMSO (log2), "Enrichi" (> enrichissement double) (a), "Inchangé" (< enrichissement double et < double épuisement) (b) et "Depleted" (>épuisement double) (c). d – f Les groupes His10-Ub dans les échantillons traités au PR619 par rapport à leur regroupement dans les échantillons traités au MG132 avec la distribution du groupe PR619 "enrichi" en d, la distribution du groupe "inchangé" en e et la distribution du groupe "appauvri" en f. g–i Dynamique des substrats His10-Ub identifiés dans les échantillons traités au MG132 regroupés selon les mêmes critères avec les groupes « Enrichi » (g), « Inchangé » (h) et « Épuisé » (i). j – l Les groupes His10-Ub dans les échantillons traités au MG132 comparés à leur regroupement dans les échantillons traités au PR619 avec la distribution du groupe « Enrichi » de MG132 en j, la distribution du groupe « Inchangé » en k et la distribution du groupe « Épuisé » en l. m, n Distributions de groupes de protéines exclusivement identifiées dans des échantillons inhibés par Dub (m) ou des échantillons inhibés par le protéasome (n). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Par la suite, nous avons effectué une corrélation de Pearson en comparant chaque échantillon UbiSite les uns aux autres et avons trouvé une corrélation raisonnable entre les répliques (~ 0, 65 corrélation de Pearson) avec une corrélation plus faible entre les traitements (~ 0, 40 corrélation de Pearson) (Fig. 3a supplémentaire). Pour accroître la confiance dans les quantifications MS, nous avons utilisé l'acquisition indépendante des données (DIA) de peptides ubiquitinés purifiés avec la technologie UbiSite avec dix fois moins de matériel de départ. Le matériel d'entrée avant l'enrichissement UbiSite de chaque échantillon a montré des effets reproductibles des traitements inhibiteurs par immunoblot sur les cinq répétitions (Fig. 4a). La méthode d'acquisition DIA a réduit considérablement le nombre de sites exclusivement identifiés entre les échantillons inhibés par le protéasome ou le DUB, cependant, une grande partie des sites n'ont pas été identifiés dans les échantillons traités au DMSO (Fig. 4b). Nous avons identifié> 20 000 sites Ub dans des échantillons inhibés par le protéasome ou DUB et> 11 000 sites Ub dans des échantillons traités au DMSO avec un nombre constant de sites identifiés entre les réplicats, avec quelques variations dans les échantillons traités au MG132 (Fig. 4c). L'analyse en composantes principales a révélé un fort regroupement d'échantillons par traitement (Fig. 4d). Un regroupement hiérarchique par distance euclidienne a été effectué pour visualiser chaque intensité de site Ub dans chaque échantillon par rapport à son intensité moyenne sur tous les échantillons (intensité notée Z par soustraction de la moyenne), où une grande valeur dénote une intensité élevée et une faible valeur a une faible intensité et une couleur grise indiquent une valeur manquante (Fig. 4e). Le regroupement hiérarchique a révélé de grands groupes de sites Ub avec des intensités différentielles dans les traitements MG132 et PR619.

a Immunoblots d'échantillons d'entrée U2OS traités pendant 3 h avec DMSO, MG132 (10 µM) ou PR619 (20 µM) et colorés pour Ub (P4D1), n ​​= 5 échantillons biologiquement indépendants. b Les sites DiGly ont été identifiés à l'aide de la technologie UbiSite en mode d'acquisition indépendante des données (DIA). Les données ont été filtrées comme décrit dans la section méthodes. Diagramme de Venn des sites Ub identifiés par traitement, où les sites identifiés dans au moins une répétition dans plusieurs traitements ont été considérés comme des intersections, n = 5. c Nombre de sites diGly identifiés par traitement, où chaque point de données est représenté par un cercle coloré, le la boîte contient le 25–75e centile et la ligne orange indique la moyenne et les barres d'erreur représentent l'écart-type, n = 5 échantillons biologiquement indépendants. d Analyse en composantes principales des données UbiSite DIA en utilisant les composantes avec la variance expliquée la plus élevée, n = 5. e Regroupement hiérarchique par distance euclidienne où chaque colonne de la carte thermique est un échantillon et chaque ligne est un site Ub (prétraité avec k-means , 300 clusters, 1000 itérations). Les valeurs d'intensité du site Ub ont été normalisées par le score Z (soustraction de la moyenne) et les valeurs manquantes sont indiquées par une couleur grise, n = 5. Les données sources sont fournies sous forme de fichier Source Data.

Nous avons observé une corrélation très élevée entre les cinq répliques d'UbiSite DIA (~0,95 corrélation de Pearson) et une corrélation plus modeste entre les traitements MG132 et PR619 (~0,60 corrélation de Pearson), qui était comparable aux corrélations entre MG132 et DMSO (~0,68 corrélation de Pearson ) ou PR619 et DMSO (corrélation de Pearson ~ 0, 55) (Fig. 3b supplémentaire). Nous avons effectué la même analyse de corrélation sur les données His10-Ub pour les traitements DMSO, MG132 et PR619 pour voir si les différences observées au niveau du site sont également présentes au niveau des protéines. Après avoir filtré les liants de fond comme décrit dans les méthodes, nous avons trouvé une forte corrélation entre les répliques (~0,80 corrélation de Pearson), une faible corrélation entre les traitements MG132 et PR619 (~0,50 corrélation de Pearson), une corrélation modeste entre MG132 et DMSO (~0,70 corrélation de Pearson) et une faible corrélation entre le PR619 et le DMSO (corrélation de Pearson ~ 0,50) (Fig. 4 supplémentaire). Ensuite, le regroupement hiérarchique et l'analyse des composants principaux ont été effectués sur les données His10-Ub, qui récapitulent nos résultats dans les données spécifiques au site (Fig. 5a, b supplémentaires). Pris ensemble, ces résultats confirment notre observation antérieure d'une nette différence entre les sites Ub ou les protéines modifiées par Ub enrichies après inhibition du protéasome ou du DUB, indiquant que les DUB et le protéasome régulent des ensembles préférentiels de substrats et de sites.

Ensuite, nous avons effectué une analyse du réseau STRING des interactions protéiques (seuil de confiance = 0,9) sur toutes les protéines identifiées dans trois répétitions dans au moins un traitement dans l'ensemble de données UbiSite DIA. Le réseau a été divisé en sous-clusters les plus interconnectés avec MCODE (paramètres par défaut). Ensuite, nous avons effectué une analyse d'enrichissement fonctionnel sur chaque sous-groupe par rapport au protéome humain complet. La dynamique de chaque site Ub en réponse au protéasome ou à l'inhibition DUB a été codée par couleur en fonction du changement de pli par rapport au DMSO, où une couleur grise indique que le site Ub n'a pas été identifié dans ce traitement. Le site Ub le plus N-terminal est visualisé à 12 heures du nœud et progresse dans le sens des aiguilles d'une montre jusqu'au site Ub le plus C-terminal > 11 heures. La couleur de l'anneau extérieur représente le changement de pli PR619 par rapport au DMSO et la couleur de l'anneau intérieur représente le changement de pli MG132 par rapport au DMSO. La taille du nœud représente le nombre de sites Ub identifiés sur cette protéine. Compte tenu de la grande quantité de clusters de réseau identifiés, seuls quelques clusters sont affichés dans (Fig. 5), avec des clusters supplémentaires présents dans (Dataset 1). De plus, la même analyse de réseau a été effectuée sur les données UbiSite DDA (Datasets 2 et 3). Bien que de nombreux sites aient une dynamique similaire en réponse au DUB ou à l'inhibition du protéasome, de nombreuses protéines faisant partie du même réseau fonctionnel ont des sites Ub qui répondent différemment ou ont été identifiés exclusivement dans le traitement MG132 ou PR619, soulignant les impacts préférentiels du protéasome et des DUB. sur l'ubiquitinome.

Analyse du réseau des protéines et de leurs sites Ub identifiés dans les cinq répliques UbiSite DIA des cellules traitées par MG132 ou PR619. Les réseaux ont été générés à l'aide de la base de données STRING des interactions protéine-protéine (seuil de confiance = 0,9) et regroupés dans les réseaux les plus interconnectés à l'aide de MCODE (paramètres par défaut). Un enrichissement fonctionnel a été réalisé sur chaque sous-cluster avec le génome humain en arrière-plan. Le processus ou complexe biologique le plus important est affiché sous forme de titre pour chaque sous-cluster, ou codé par couleur au centre du nœud pour les sous-clusters plus grands. La dynamique de chaque site Ub en réponse au protéasome (MG132) ou à l'inhibition DUB (PR619) a été codée par couleur en fonction du changement de pli par rapport au DMSO (log2), où une couleur grise indique que le site Ub n'a pas été identifié dans ce traitement. Le site Ub le plus N-terminal est visualisé à 12 heures du nœud et progresse dans le sens des aiguilles d'une montre jusqu'au site Ub le plus C-terminal à 11 heures. La couleur de l'anneau extérieur représente le changement de pli PR619 par rapport au DMSO et la couleur de l'anneau intérieur représente le changement de pli MG132 par rapport au DMSO. La taille du nœud représente le nombre de sites Ub identifiés sur cette protéine. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour rechercher s'il existe des motifs distincts pour les sites Ub exclusivement significatifs dans les échantillons inhibés par le protéasome, DUB ou Ub E1, nous avons effectué une analyse de séquence des 15 acides aminés en amont et en aval des lysines conjuguées à Ub (Fig. 6a – c supplémentaires). Les sites Ub qui ont été identifiés dans les trois réplicats d'échantillons traités au DMSO et qui étaient inchangés par rapport à tout traitement ont été utilisés comme contrôle (Fig. 6d supplémentaire). Le rapport des fréquences d'acides aminés proches de la lysine ubiquitinée était similaire pour chaque traitement (Fig. Supplémentaire 6a – c). Des changements minimes dans les motifs de séquence ont été trouvés par rapport au DMSO (log2 fold-change) quel que soit le type de traitement (Fig. 6e – g supplémentaire) avec une modeste diminution du double des cystéines à proximité des sites Ub identifiés dans des échantillons de cellules traitées avec l'inhibiteur DUB, correspondant à un changement total de motif inférieur à 1% (Fig. 6g supplémentaire).

L'accessibilité de surface des sites Ub identifiés dans le protéasome ou les échantillons inhibés par DUB a été analysée en comparant des fenêtres de séquence contenant 15 acides aminés en amont et en aval des sites Ub identifiés (Fig. 6h, i supplémentaires). Pour comparer les sites uniques à l'un ou l'autre traitement, nous avons analysé les 100 premiers sites avec le plus grand changement de facteur par rapport au DMSO de l'un ou l'autre traitement, tout en ayant un facteur de changement <1 dans l'autre traitement. En tant que contrôle, nous avons randomisé 100 peptides de longueur égale et effectué l'analyse sur cet ensemble également. Les sites identifiés dans les échantillons inhibés par le protéasome et le DUB étaient un peu moins accessibles en surface que le contrôle randomisé, les sites identifiés dans les échantillons inhibés par le DUB étant les moins accessibles en surface.

Par la suite, nous avons examiné les effets de l'inhibition du protéasome et des DUB sur l'abondance des liaisons de la chaîne Ub dans les données UbiSite DIA (Fig. 6a, b). Ub a été tracé dans un tracé radar, où chaque direction correspond à une position de lysine. Chaque abondance de chaîne Ub dans chaque traitement est représentée par un changement de pli par rapport au DMSO où la ligne pointillée représente un changement de pli de 0. L'inhibition protéasomique a légèrement enrichi les chaînes Ub liées à K6, K11 et K27, tandis que les chaînes liées à K33 ont enrichi 3 plier37. Les chaînes liées à K33 et K63 se sont clairement enrichies après inhibition DUB tandis que les chaînes liées à K48 étaient légèrement enrichies et les chaînes liées à K11 appauvries deux fois. Nous avons observé un épuisement de toutes les chaînes Ub en réponse au traitement par TAK243 dans les échantillons UbiSite DDA, bien que les chaînes liées à K48 et K63 n'aient montré qu'un épuisement modeste, indiquant qu'elles représentent les chaînes les plus stables (Fig. 6c).

une séquence d'acides aminés de Ub et d'autres Ubl avec des lysines internes mises en évidence. b Tracé radar des sites Ub identifiés à l'aide de la méthodologie d'acquisition UbiSite DIA, où chaque segment représente une position de lysine (K) sur Ub. Les données sont tracées en tant que changement de pli par rapport au DMSO (log2) du traitement inhibiteur de l'UPS indiqué à 3 h. La ligne pointillée représente 0, n = 5. c sites diGly sur Ub dans les données UbiSite DDA après 3 h de traitement TAK243, les données sont représentées sous forme de changement de facteur log2 vs DMSO et -log10 p valeur (test t de Student, FDR = 0,05, S0 = 0,1), n ​​= 3. d–g Tracés radar supplémentaires avec des sites diGly identifiés sur NEDD8 (d), SUMO1 (e), SUMO2 (f) et SUMO3 (g) dans les données UbiSite DIA, n = 5. Les données sources sont fourni sous forme de fichier de données source.

Par la suite, nous avons étudié la diaphonie entre Ub et les modificateurs de type ubiquitine (Ubls), en nous concentrant sur la formation de polymères mixtes. Chaque Ubl a été tracé dans un tracé radar où chaque direction représente une position de lysine sur cet Ubl à l'aide des données UbiSite DIA (Fig. 6d – g). La modification Ub de NEDD8 sur K48 et dans une moindre mesure sur K11 a également été enrichie après l'inhibition du protéasome, et ces chaînes ont été efficacement éliminées par les protéases (Fig. 6d). L'abondance relative de SUMO2 / 3 modifié par Ub a fortement augmenté lors de l'inhibition du protéasome et de l'inhibition du DUB sur chaque position de lysine identifiée (Fig. 6f, g).

En cartographiant les protéines avec un site Ub identifié dans l'ensemble de données DDA vers la base de données d'enzymes BRENDA, nous avons trouvé 2050 enzymes ubiquitinées, la majorité des enzymes modifiées par Ub étant exclusivement identifiées dans les échantillons inhibés par DUB, mais certaines étaient exclusives aux échantillons inhibés par le protéasome. Figures 7a, b)38. Les enzymes associées à Ub telles que les DUB et les ligases étaient plus ubiquitinées en réponse au traitement PR619 par rapport au traitement MG132 (Fig. 7c, d supplémentaires). De plus, nous avons trouvé plus de phosphosites dans les échantillons d'UbiSite traités au PR619 (Fig. 7e, f supplémentaires) (Ensemble de données supplémentaire 7). Ces résultats étaient cohérents avec les données UbiSite DIA, bien qu'avec beaucoup moins de valeurs manquantes (Fig. 8a, b supplémentaires).

Nous avons estimé que l'ubiquitination des enzymes pouvait réguler leur activité et en raison d'un schéma d'ubiquitination frappant, nous nous sommes concentrés sur PARP1, qui contribue à la réparation de l'ADN par ADP-ribosylation (PARylation) des facteurs de réparation de l'ADN et des histones, conduisant à la relaxation de la structure de la chromatine39. 18 et 10 sites Ub identifiés sur PARP1 dans les données DDA et DIA respectivement, ont été trouvés uniquement dans les échantillons inhibés DUB et K97, K269, K331, K337, K629, K796, K802 et K940 étaient les sites les plus abondants et trouvés en utilisant les deux méthodes d'acquisition ( Figures 7a, b). Tous les sites Ub identifiés sur PARP1 dans le protéasome ou les échantillons inhibés par DUB ont été comparés en tant que changement de pli par rapport au DMSO, et nous n'avons trouvé aucun effet de l'inhibition du protéasome sur l'ubiquitination de PARP1 tandis que l'inhibition de DUB augmentait fortement l'ubiquitination de PARP1 dans les ensembles de données DDA et DIA (Fig. 7c, d). Une représentation schématique des sites Ub identifiés sur PARP1 met en évidence leur localisation par rapport aux domaines PARP1 (Fig. 7e). De manière cohérente, nous avons trouvé plus de PARP1 ubiquitinée dans les échantillons His10-Ub de traitements PR619 ou de traitements combinés comprenant PR619, avec des effets minimes de MG132, indiquant que la PARP1 ubiquitinée est fortement régulée par les DUB, mais pas ciblée pour la dégradation protéasomique dans les 3 h (Fig. 7f ).

a, b Carte thermique de l'intensité relative moyenne (LFQ, log2) des sites PARP1 Ub (minimum 2 valeurs valides) par traitement dans les données UbiSite DDA (a) ou UbiSite DIA (b). Les valeurs manquantes sont représentées par une case grise barrée à la position de la lysine (K). c, d Comparaison entre les sites Ub identifiés sur PARP1 après traitement MG132 ou PR619 représentés en fold-change vs DMSO (log2) dans UbiSite DDA (n = 3 échantillons biologiquement indépendants) (c) ou UbiSite DIA (n = 5 échantillons biologiquement indépendants) (d) où les barres d'erreur représentent le SD. e Vue d'ensemble schématique des domaines PARP1 avec les lysines accepteurs Ub identifiées indiquées. f PARP1 identifiée dans les échantillons His10-Ub comme un facteur de changement par rapport au DMSO pour chaque traitement et point de temps. Les barres d'erreur représentent l'écart-type et un astérisque indique une différence significative par rapport au DMSO (test t de Student bilatéral FDR < 0,05 S0 = 0,1). Les cases incluent la valeur maximale et minimale de chaque condition et chaque point de données est représenté par un symbole noir, n = 3 échantillons biologiquement indépendants. g Immunoblot de cellules U2OS traitées avec 20 µM de PR619 ou de DMSO pendant 3 h et traitement ultérieur avec 100 µM de H2O2 pendant les délais indiqués. La membrane a été sondée pour les protéines PARylées (LP-96-10), l'ubiquitine (FK2) et PARP1 (Alx-210-302), n = 4 échantillons biologiquement indépendants. h Immunoblot de PARP1 enrichi par FLAG-IP à partir de cellules GMRSiP exprimant PARP1 marqué FLAG traité avec DMSO ou 20 µM PR619 pendant 3 h. La membrane a été sondée avec l'anticorps polyclonal PARP1 (Alx-210-302) et Ub (FK2), n = 3 échantillons biologiquement indépendants. i, j La PARP1 purifiée de FLAG-IP a été immunoblottée en double sur la même membrane et divisée pour laisser un ensemble sans autre traitement afin de refléter le statut natif de la PARylation dans les cellules (panneau de gauche), tandis que l'autre ensemble a été soumis à in situ Essai de PARylation sur la membrane de nitrocellulose en ajoutant de l'ADN entaillé et du NAD pour évaluer la PARylation en réponse à des dommages supplémentaires à l'ADN (panneau de droite). Les deux ensembles de membranes ont été sondés pour les chaînes PAR longues et courtes (LP-96-10) (i) ou les chaînes PAR longues (10H) (j), n = 3 échantillons biologiquement indépendants. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Cette observation nous a conduit à étudier la PARylation dans les cellules. Nous avons traité les cellules U2OS pendant 3 h avec des inhibiteurs UPS, un inhibiteur de conjugaison SUMO comme contrôle (ML792) ou un inhibiteur PARP1/2 (Olaparib) avec ou sans traitement H2O2 pendant 10 min avant la lyse. Le PR619 n'a eu aucun effet sur la PARylation en soi, mais a considérablement augmenté la PARylation en combinaison avec H2O2, mais aucun autre inhibiteur de l'UPS testé dans cette expérience n'a eu cet effet (Fig. 9a supplémentaire).

Ensuite, l'expérience a été répétée avec différents moments de traitement au H2O2 dans les cellules GMRSiP, et nous avons observé un signal fort de protéines PARylées à 5 min après le traitement au H2O2, qui a été désactivé au bout de 45 min. En revanche, le traitement PR619 en association avec H2O2 a entraîné un signal PAR plus fort à 5 min, qui a persisté jusqu'à 5 h (Fig. 7g).

Pour déterminer si le traitement PR619 peut avoir amélioré l'activité de PARP1 cellulaire, nous avons extrait PARP1 des cellules exprimant FLAG-PARP1 traitées pendant 3 h avec du DMSO ou PR619. Les transferts ont été sondés pour l'état d'ubiquitination, PARP1 et PARylation des protéines. La plupart des PARP1 des cellules traitées avec PR619 sont restées autour de 113 kDa, mais une petite fraction de celles-ci a également été détectée juste au-dessus de la bande principale de 113 kDa (Fig. 7h, panneau PARP1 et Fig. 9b supplémentaire). Le traitement PR619 a augmenté de manière significative les protéines ubiquitinées qui ont été extraites avec FLAG-PARP1 (Fig. 7h Ub panel). Ces transferts ont été sondés pour le signal PAR dans des conditions natives afin de refléter le statut PAR initial des cellules ainsi qu'après l'activation in situ de PARP1 par l'ajout de cassures de brins d'ADN et de NAD. Nous avons utilisé l'anticorps polyclonal LP-96-10 qui détecte à la fois les petites et les grandes chaînes de PAR (Fig. 7i) et le monoclonal 10H qui ne détecte que les grandes chaînes de PAR (Fig. 7j). Le sondage LP-96-10 avant l'activation in situ a révélé PARP1 PARylé dans les cellules traitées au DMSO, mais un signal supplémentaire (1,7 fois) de protéines PARylées au-dessus de PARP1 jusqu'à 250 kDa dans les cellules traitées avec PR619 (Fig. 7i, panneau de gauche ), confirmant l'augmentation de la PARylation des protéines dans les cellules traitées avec PR619. L'activation in situ de PARP1 a augmenté le signal de PAR dans les deux conditions, avec une activation beaucoup plus forte de PARP1 à partir de cellules traitées avec PR619 par rapport aux cellules traitées avec du DMSO (Fig. 7i, panneau de droite). Notamment, le sondage 10H de ces transferts a révélé un signal PAR négligeable dans les deux échantillons dans des conditions endogènes avant l'activation de PARP1, et un signal fort pour PAR dans la position de PARP1 dans les deux échantillons avec une capacité légèrement améliorée de PARP1 à former de grands PAR dans les cellules traitées avec PR619 (Fig. 7j).

La présence plus élevée de PAR dans les cellules traitées par PR619 peut également être due à un effet hors cible de PR619 sur les activités catalytiques de PARP1 ou de la principale enzyme digérant PAR poly (ADP-ribose) glycohydrolase (PARG). Par conséquent, nous avons examiné l'activité catalytique de ces deux enzymes purifiées par des tests d'activité in vitro, et donc exemptes d'autres effets cellulaires de PR619. Les tests enzymatiques in vitro de PARP1 et PARG purifiés ont confirmé que PR619 n'avait aucun effet direct sur les activités catalytiques de l'une ou l'autre de ces enzymes (Fig. 9c, d supplémentaires). Ainsi, l'ubiquitination de PARP1 a augmenté la PARylation à petite chaîne de nombreuses protéines, y compris PARP1, et PARP1 ubiquitinée conserve la capacité d'être activée en présence de dommages supplémentaires à l'ADN pour former à la fois de petites et de grandes chaînes PAR.

Nous avons étudié les altérations à l'échelle du système dans la dynamique de l'Ub lors de l'inhibition du protéasome, du DUB et/ou de l'Ub E1, en utilisant deux méthodes complémentaires pour purifier les sites et les substrats Ub. Nous avons identifié 55 355 sites Ub uniques, soulignant la complexité de la transduction du signal Ub. 37% de ces sites n'ont pas été identifiés par Akimov et al.28 en utilisant la même approche UbiSite de pointe, bien que dans les cellules Jurkat et Hep2 (Fig. 10a supplémentaire) (Ensemble de données supplémentaire 9). De plus, 30 % des sites identifiés dans cette étude n'avaient pas été signalés auparavant sur PhosphoSitePlus, www.phosphosite.org (Fig. 10b supplémentaire)40.

Alors que la fonction classique d'Ub cible les protéines pour la dégradation du protéasome, nous avons remarqué une dynamique relativement modeste des substrats et des sites Ub en réponse à l'inhibition du protéasome dans un laps de temps de 3 h, par rapport aux altérations frappantes observées lors de l'inhibition du DUB (Fig. 2e, f )2,9,10,11,41. Les sites Ub identifiés dans notre approche DIA ont montré un fort regroupement spécifique au traitement par analyse en composantes principales et les intensités des sites diGly différaient fortement entre les échantillons inhibés par le protéasome et DUB (Fig. 4d, e). Nous avons noté une tendance similaire dans l'évolution temporelle de His10-Ub, où la plupart (67%) des substrats Ub enrichis après l'inhibition DUB n'ont pas été identifiés dans les échantillons inhibés par le protéasome (Fig. 3). Nos résultats indiquent donc que les DUB et le protéasome régulent des pools de substrats qui se chevauchent et sont indépendants, agissant souvent de manière distincte plutôt que compétitive. Fait intéressant, les objectifs indépendants du protéasome peuvent constituer la majorité des événements de signalisation Ub.

Étant donné que seuls les DUB de cystéine sont inhibés par PR619, la contribution des DUB à la dynamique de l'Ub peut être sous-estimée dans nos données car les DUB de métalloprotéase restent actifs. Parmi les DUB associés au protéasome RPN11, USP14 et UCHL5 : RPN11 est une métalloprotéase qui favorise la dégradation du substrat tandis que les protéases à cystéine USP14 et UCH37 s'opposent à la dégradation, ce qui pourrait expliquer pourquoi PR619 n'a pas inhibé la dégradation du protéasome (Fig. 1a supplémentaire)42,43 . Il a déjà été démontré que PR619 inhibe la plupart des DUB. Dans un panel de 32 DUB, 27 étaient inhibés par PR619, tandis que les membres de la famille JAMM n'étaient pas affectés, car ils ne contiennent pas de résidu cystéine réactif mais sont des zinc-métalloprotéases29. Nos résultats sont cohérents avec un autre inhibiteur de la cystéine-protéase DUB à large spectre, Ub vinyl sulfone, qui a rapidement appauvri l'Ub libre en favorisant l'ubiquitination des substrats non protéolytiques, confirmant le rôle clé des DUB dans la régulation de la dynamique de l'Ub44. La régulation des substrats Ub par les DUB d'une manière indépendante du protéasome permet une transduction rapide du signal similaire à d'autres PTM comme la phosphorylation.

Nous avons constaté que les DUB traitent les protéines ubiquitinées dans des conditions d'inhibition de la traduction, révélant que les substrats DUB s'étendent au-delà des protéines mal repliées nouvellement synthétisées qui sont connues pour constituer des substrats protéasomaux (Fig. 2j). La signalisation Ub indépendante du protéasome et la régulation DUB de ces voies ont été largement étudiées16,17,18,23,45,46. Fait intéressant, jusqu'à un tiers de toutes les protéines nouvellement synthétisées sont des produits ribosomiques défectueux qui sont ubiquitinés et dégradés en raison d'un traitement post-traductionnel défectueux nécessaire pour que les protéines obtiennent un repliement correct35. Kim et al.24 ont montré une accumulation de protéines ubiquitinées principalement après 8 h d'inhibition du protéasome, et cette augmentation dépendait de la synthèse active des protéines, conformément à nos résultats (Fig. 2j). De plus, aucune corrélation n'a été trouvée entre l'abondance totale d'une protéine et l'abondance modifiée diGly, et des changements dans les niveaux totaux de protéines cibles lors de l'inhibition du protéasome ont été trouvés pour un ensemble très limité de substrats24,28, indiquant que l'effacement des protéines de style manuel par l'Ub- système du protéasome sont des événements rares.

Notre étude donne un aperçu de la dynamique des différents polymères Ub. Les chaînes Ub liées à K48 et K63 sont les polymères les plus stables lors de l'inhibition de la conjugaison Ub par rapport aux autres liaisons, ce qui était inattendu (Fig. 6c). Nos résultats indiquent que la dégradation protéasomique des substrats conjugués aux chaînes Ub liées à K48 et à d'autres chaînes Ub est un processus relativement lent, bien que la forte abondance de peptides correspondant aux chaînes Ub puisse entraîner une compression du rapport, conduisant à une sous-estimation de leur dynamique (Fig. 1b, c). De plus, MG132 ne devrait pas inhiber les DUB associés au protéasome, par conséquent, ils peuvent toujours éliminer les chaînes Ub liées à K48 des substrats, expliquant en partie leur modeste accumulation en réponse à MG132. Les études qui mettent en évidence le rôle des chaînes Ub liées à K48 utilisent fréquemment des inhibiteurs du protéasome pendant des périodes plus longues par rapport à la période de 3 h utilisée dans notre étude24,47,48. Nous avons observé la plus grande différence entre l'inhibition du protéasome et l'inhibition du DUB pour les chaînes liées à K63, ce qui indique que ces chaînes fournissent des signaux indépendants du protéasome, conformément aux découvertes précédentes (Fig. 6b)37.

Chacune des différentes liaisons de la chaîne Ub a été impliquée dans des processus biologiques distincts ; Les chaînes liées à K6 sont assemblées par le complexe BRCA/BARD1 ligase, qui fonctionne dans la réparation de l'ADN49. Les chaînes liées à K11 ont été associées à la dégradation associée au réticulum endoplasmique et à la dégradation des régulateurs du cycle cellulaire par le complexe promoteur de l'anaphase (APC/C)37,50. De plus, l'APC/C conjugue les chaînes Ub ramifiées liées à K11 et K48, ce qui améliore la reconnaissance du substrat par le protéasome51. Nous avons trouvé un enrichissement modeste des chaînes liées à K11 après l'inhibition du protéasome et, fait intéressant, ce type de chaîne a été appauvri après l'inhibition du DUB (Fig. 6b). Il a été suggéré que la structure des chaînes liées à K27 transmet une résistance contre la plupart des DUB et nous n'avons systématiquement observé aucune accumulation de chaînes liées à K27 après l'inhibition de DUB (Fig. 6b) 52 . On sait peu de choses sur les chaînes Ub atypiques liées à K29 et K33, mais elles se lient au doigt de zinc N-terminal de TRABID, un OTU DUB et régulateur positif de la transcription induite par Wnt, qui se lie et clive également les chaînes Ub liées à K63, qui constituent des fonctions non protéolytiques37,53,54. Cependant, nous avons remarqué un net enrichissement des chaînes liées à K33 suite à l'inhibition à la fois du protéasome et du DUB (Fig. 6b). Récemment, il a été démontré que les chaînes Ub liées à K29 jouaient un rôle dans la réponse au stress protéotoxique et dans la progression du cycle cellulaire55. Les chaînes Ub linéaires sont impliquées dans la signalisation et l'immunité du facteur de nécrose tumorale (TNF) par association avec le facteur nucléaire-κB (NF-κB) par le modulateur essentiel NF-κB (NEMO), qui lie spécifiquement les chaînes Ub linéaires via son UBAN (liaison à l'ubiquitine). dans ABIN et NEMO) motif56,57. Cependant, le code Ub est stupéfiant dans sa complexité et l'importance de liaisons de chaînes spécifiques peut être généralisée de manière incorrecte à partir d'un ensemble limité de substrats identifiés.

Nous avons observé une forte accumulation de SUMO2 / 3 ubiquitiné sur K11, K20 / 21, K32 / 33 et K44 / 45 après 3 h de protéasomal, mais chacune de ces liaisons a été efficacement clivée par les DUB (Fig. 6f, g). De plus, les substrats co-modifiés His10-Ub et SUMO2 / 3 ont été enrichis après inhibition du protéasome (Fig. 1d supplémentaire). SUMO2/3 ubiquitiné représente donc un fort signal de dégradation. SUMO1 ubiquitiné à K7 et K17 s'est accumulé plus modestement après l'inhibition du protéasome (Fig. 6e). L'ubiquitination des protéines SUMOylées est réalisée par des ligases d'ubiquitine ciblées SUMO (STUbL) et comprend l'ubiquitination de la machinerie de conjugaison SUMO auto-SUMOylée58,59. L'ubiquitination de K48 sur NEDD8 s'est également accumulée lors de l'inhibition du protéasome et cette liaison a été efficacement clivée par les DUB (Fig. 6d). Ce polymère mixte ressemble probablement à Ub lié à K48 car NEDD8 a une homologie étendue avec Ub (58 % d'identité de séquence et 80 % de similarité de séquence).

Nous avons identifié une quantité substantielle de sites Ub sur des enzymes exclusivement dans des échantillons inhibés par DUB (Fig. 7a, b et 8a, b supplémentaires), indiquant que la modification d'Ub peut réguler l'activité enzymatique sans cibler les enzymes pour la dégradation du protéasome. Nous avons identifié ce modèle d'ubiquitination frappant sur l'enzyme de PARylation PARP1. Dans la littérature, l'ubiquitination de PARP1 a été liée à sa dégradation protéasomique60,61,62. En revanche, nous n'avons trouvé aucun effet de l'inhibition du protéasome pendant 3 h sur l'ubiquitination de PARP1 (Fig. 7a – d). Au lieu de cela, nous avons observé une ubiquitination étendue sur les lysines partout dans PARP1 lors de l'inhibition de DUB et avons démontré que PARP1 ubiquitinée est plus active que son homologue non modifié (Fig. 7). Nous avons confirmé que PR619 n'active ni n'inhibe directement PARP1 ou PARG purifiés (Fig. 9c, d supplémentaires). Nos résultats indiquent donc que la PARP1 ubiquitinée est enzymatiquement plus active. Fait intéressant, des découvertes récentes ont montré que PARP1 est lié par un trimère NEDD8 acétylé non ancré après un traitement au H2O2, qui a inhibé l'activité de PARylation de PARP163. De plus, il a été démontré que la PARP1 piégée par la chromatine était SUMOylée par PIAS4 et séquentiellement ubiquitinée par le STUbL RNF4, ce qui a permis l'élimination de la PARP1 piégée par VCP64. Ensemble, ces résultats mettent en évidence une modulation importante de l'activité de PARP1 par Ub et Ubls.

Les anticorps DiGly sont l'outil le plus largement utilisé pour identifier les sites Ub endogènes, et ils reconnaissent le fragment trypsique diGly de Ub conjugué au substrat lysine et sont donc incapables de reconnaître les événements d'ubiquitination non lysine. L'anticorps UbiSite reconnaît le fragment Lys-C de Ub indépendamment de son site de conjugaison, permettant l'identification d'événements d'ubiquitination non lysine28. De nouvelles preuves suggèrent que les résidus cystéine, sérine et thréonine, ainsi que les extrémités N-terminales des protéines peuvent être ubiquitinés28,65,66,67,68,69. Plusieurs protéines ubiquitinées N-terminales ont en effet été identifiées dans notre étude (Supplementary Dataset 8). Cependant, nous n'avons pas été en mesure d'identifier d'autres peptides modifiés par Ub non lysine à haut niveau de confiance, ce qui indique qu'il s'agit d'événements rares.

Notre étude fournit une ressource d'ubiquitination spécifique au site pour faciliter l'analyse de la signalisation Ub spécifique au substrat, en se concentrant sur la dynamique en réponse au traitement par inhibiteur de l'UPS (ensembles de données supplémentaires 4, 5, 6). Dans notre étude, nous avons découvert que les DUB et le protéasome ont des ensembles de substrats largement séparés. Alors que le protéasome cible les protéines fraîchement traduites mal repliées, les DUB ciblent également les protéines matures. Relier les fonctions aux modifications Ub individuelles et cartographier leurs DUB régulateurs est une tâche ardue qui nécessitera un travail de suivi approfondi et nécessite de nouveaux inhibiteurs spécifiques de DUB. Les DUB constituent des cibles thérapeutiques prometteuses, comme le soulignent leur fréquente dérégulation, surexpression ou mutation dans la maladie4,70,71,72. Le développement d'inhibiteurs spécifiques de l'USP7 offre de nouvelles voies intéressantes de pharmacogabilité des DUB pour le cancer, les maladies neurodégénératives et autres72,73,74.

Les cellules U2OS ont été cultivées dans du milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (Life Technologies) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (Life Technologies) et de 100 U/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine (Life Technologies) sur des plaques de 145 mm (Greiner bio-one, Cellstar, Cat:639160). Des lignées cellulaires ont été générées par transduction lentivirale d'une construction codant pour His10-Ub et un gène de résistance à la puromycine séparés par un IRES75. Les cellules transduites ont été sélectionnées avec 5 ug/ml de puromycine pendant 24 h.

Les cellules U2OS et HeLa ont été traitées pendant 3 h avec 1 µm TAK243, 10 µm MG132, 20 µm PR619, 20 µM WIN 62,577 (Sigma, Cat : W104) ou DMSO. 250 µM Me4BodipyFLAhx3Leu3VS ont été ajoutés 10 min avant la récolte des cellules en lavant deux fois avec du PBS glacé et en lysant dans un tampon de lyse RIPA (25 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % SDS, 0,5 % désoxycholate de sodium, 1 % Triton X-100 , inhibiteur de protéase sans EDTA)76. Les échantillons ont été égalisés et préparés pour l'électrophorèse sur gel comme décrit ci-dessus. Les échantillons ont été analysés sur des gels Bis-Tris à 12 % (ThermoFisher Scientific, Cat : NP0341PK2) et la fluorescence a été mesurée à l'aide d'un Typhoon FLA 9500 (GE Healthcare) à l'aide d'un laser de 473 nm (Rho) et de filtres d'émission de 530 nm (Rho). Les gels ont ensuite été utilisés pour WB et colorés pour l'ubiquitine comme décrit ci-dessus.

Les cellules U2OS ont été traitées avec des inhibiteurs de protéasome MG132, Bortezomib (Selleckchem, Cat : S1013), Carfilzomib (Selleckchem, Cat : S2853) ou DMSO pendant 10, 30, 60 ou 180 min dans des plaques de 24 puits (Corning, Cat : 3527) et traités avec l'inhibiteur DUB PR619 ou DMSO dans des plaques de 145 mm (Greiner bio-one, Cellstar, Cat: 639160). Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS glacé, grattées avec un grattoir en caoutchouc et collectées, centrifugées à 500 rcf pendant 5 min puis lysées dans un tampon de lyse SNTBS (2% SDS, 1% NP-40, 50 mM Tris-HCL pH 7,5, 150 mM NaCl) avec un fort vortex. Les échantillons ont été égalisés à l'aide d'acide bicinchoninique (BCA) (ThermoFisher Scientific, Cat: 23227) avec des normes de concentration de protéines d'albumine sérique bovine (BSA) et préparés pour l'immunotransfert comme décrit ci-dessous. L'intensité du frottis Ub et de la β-actine a été quantifiée avec ImageJ (1.52a).

Les cellules U2OS ont été traitées avec des inhibiteurs UPS comme décrit ci-dessus avec 50 µg/ml de cycloheximide (CHX) (Sigma, Cat : C7698) ou de DMSO ajoutés simultanément et incubés pendant 3 h, puis lavés deux fois avec du PBS glacé et lysés dans un tampon de lyse SNTBS . Les échantillons ont été égalisés par BCA et préparés pour WB comme décrit ci-dessus.

Les échantillons ont été égalisés par BCA et dilués dans un tampon d'échantillon LDS (Invitrogen, Cat: NP0007) et 100 mm DTT (Sigma, Cat: D0632), séparés par électrophorèse sur gel dans des mini réservoirs de gel (Thermo fisher Scientific, Cat: NW2000) avec source d'alimentation (Bio-rad, Cat : 1645070) (150 V, 1 h), en utilisant des gels de gradient NOVEX 4-12 % Bis-Tris (Thermo Fisher Scientific, Cat : NW04125BOX) et transférés sur une membrane de nitrocellulose de 0,45 μm (Millipore, Cat : SCGPU05RE ). Les membranes ont été bloquées dans du lait écrémé à 5 % (Van Hoeckel) dissous dans du PBS additionné de 0,05 % de Tween20 (PBST) (Sigma-Aldrich, Cat : 9005-64-5) pendant 30 min à température ambiante puis sondées avec un anticorps primaire o/ n à 4 °C. Les membranes ont ensuite été lavées trois fois 15 min avec du PBST et sondées avec du secondaire pendant 3 h à 4 ° C. Les mêmes étapes de lavage ont été répétées avec un lavage supplémentaire avec du PBS avant de développer des membranes avec le substrat Clarity™ ECL (Bio-Rad, Cat : 1705060). Les anticorps ont été dilués dans du lait à 5 % dans du PBST et utilisés dans des dilutions ; anti-Ub (P4D1) 1:1000 (Santa Cruz, Cat : sc-8017), anti-UbK48 1:1000 (Millipore, Cat : 05-1307), anti-UbK63 1:1000 (Cell Signaling Technology, Cat : 5621 S), anti-SUMO2/3 1:500 (Abcam, Cat : ab81371) anti-PAR 1:1000 (Trevigen, Cat : 4335-MC-100) anti-β-Actin 1:5000 (Sigma-Aldrich, Cat : A5441). Un anti-souris de chèvre conjugué à la peroxydase a été utilisé comme anticorps secondaire dilué au 1:2500 dans du lait à 5 % dans du PBST (Sanbio, Cat : 115-035-146). La chimiluminescence a été mesurée dans un ChemiDoc (Bio-Rad, Cat : 17001401). Des analyses non recadrées et non traitées de tous les transferts sont fournies dans le fichier de données source ou sous forme de figure supplémentaire dans les informations supplémentaires.

FLAG-PARP1 a été enrichi à partir de lysats de cellules GMRSiP exprimant FLAG-PARP1 résistant à l'ARNi en utilisant des billes magnétiques anti-FLAG M2 (Sigma-M8823) comme décrit précédemment77. Le FLAG-PARP1 lié aux billes a été lavé trois fois avec du TBS-0, 05% de Tween et élue en ajoutant 2 × tampon de charge. Les immunoblots d'activité PARP1 ont été réalisés comme décrit précédemment78. En bref, l'éluat de FLAG-PARP1 IP de 2 à 6 × 106 cellules a été résolu sur un gel SDS-PAGE à 8 %. Les protéines ont été renaturées en trempant le gel dans 20 à 30 mL de tampon courant contenant 5 % de β-mercaptoéthanol pendant 1 h à 37 °C. Les protéines ont été transférées sur de la nitrocellulose et la membrane a été incubée dans un tampon de renaturation (50 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,3 % Tween20, 20 µM acétate de Zn, 2 mM MgCl2) avec 100 µM NAD et 2 µg/ mL d'ADN entaillé (entaillé avec DNAase, Sigma Cat : D4522) pendant 1 h à température ambiante. Les membranes ont été lavées quatre fois avec un tampon de lavage SDS (50 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 2% SDS) pour éliminer la liaison non spécifique et sondées pour PAR en utilisant 10H (1/500) ou LP- 96-10 (1/5000, Aparptosis), pour l'Ubiquitine (clone FK2, 1/500, Millipore) et pour PARP1 (polyclonal 1/5000, Alexis). Anticorps secondaires Goat anti-Mouse 1:5000 (Jackson ImmunoResearch, Cat: 115-035-062) et Goat anti-Rabbit 1:5000 (Jackson ImmunoResearch, Cat: 111-035-144).

L'auto-PARylation de PARP1 suivie d'un traitement avec la poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG) pour digérer les chaînes PAR a été réalisée comme décrit précédemment79. En bref, un mélange de 10 μl pour la réaction de PARylation a été préparé avec les composants suivants : 250 ng PARP1, 2 μg d'ADN coupé (coupé avec DNAase, Sigma Cat : D4522), 20 μM NAD, tampon contenant 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 10 % glycérol, 1,5 mM DTT. La réaction a été incubée à 30 ° C pendant 15 min et a été arrêtée en ajoutant un inhibiteur de PARP (100 µM PJ34 ou 1 µM Olaparib). La réaction a ensuite été divisée en aliquotes de 2 µl (chacune contenant l'équivalent de 50 ng de PARP1) auxquelles ont été ajoutés 5 µl de tampon glycohydrolase 2X (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, KCl 50 mM, DTT 1,5 mM, 0,1 mg/ ml BSA, EDTA 2,5 mM) et 5 ng de glycohydrolase (SRP8023, Sigma-Aldrich, Cat : SRP8023) avec ou sans PR619 20 µM, et volume complété à 10 µl avec de l'eau. Les échantillons ont été incubés à 30°C pendant 15 min. La réaction a été arrêtée en ajoutant 10 µl de 2 × LDS et séparée sur une SDS-PAGE à 6 %, transférée sur une membrane de nitrocellulose et sondée pour PAR en utilisant l'anticorps 10H, puis sondée pour PARP1 en utilisant l'anticorps polyclonal PARP1. Le 10H monoclonal anti-pADPr a été purifié à partir du milieu de culture de l'hybridome 10H obtenu auprès du Dr M. Miwa, National Cancer Center Research Institute, Tokyo, via la banque de cellules Riken et utilisé à 1:500 et l'anticorps polyclonal PARP1 (1:5000 ) a été obtenu auprès d'Alexis Biochemicals.

Les cellules U2OS exprimant His10-Ub ont été traitées avec 1 µM TAK243 (Active Biochem, Cat : A-1384), 10 µM MG132 (Sigma, Cat : C2211) ou 20 µM PR619 (Tebu-bio, Cat : SI9619) dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) (Sigma, Cat : D2650) pendant 10, 30, 60 ou 180 min et DMSO pendant 180 min comme contrôle. Pour les traitements combinés, les inhibiteurs ont été ajoutés simultanément. Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS glacé, récupérées par grattage et centrifugées à 500 rcf pendant 5 min à 4 °C. Les surnageants ont été décantés et les culots ont été remis en suspension dans du PBS glacé. Des échantillons d'entrée de 2,5 % de l'échantillon total ont été prélevés pour l'immunoblot (WB) et lysés séparément dans un tampon de lyse SNTBS. Les cellules restantes ont été centrifugées à nouveau à 500 rcf pendant 5 min à 4 °C. Les culots cellulaires ont été lysés dans un tampon de lyse de guanidine (guanidine-HCl 6 M, Na2HPO4/NaH2PO4 0,1 M pH 7,8, Tris-HCL 10 mM, pH 7,8, filtré à l'aide d'une Stericup (Millipore, Cat : SCGPU05RE)). Les lysats ont été soniqués (Misonix Sonicator 3000) deux fois pendant 5 s à 80 % de puissance. La concentration en protéines des lysats a été déterminée à l'aide de BCA en triple exemplaire. Les lysats ont été égalisés à 1,5 mg/ml de protéine avec un tampon de lyse à la guanidine dans un volume total de 6 ml. 50 mM d'imidazole et 5 mM de β-mercaptoéthanol ont été ajoutés à chaque échantillon. Des billes de nickel-acide nitrilotriacétique-agarose (Ni-NTA) (Qiagen, Venlo, NL) ont été utilisées pour enrichir les conjugués His10-Ub. 120 µl d'une bouillie de billes à 50 % ont été prélavés quatre fois avec le tampon de lavage A (tampon de lyse additionné de 10 mM d'imidazole pH 8, 5 mM de β-mercaptoéthanol et 0,1 % de Triton X-100), puis ajoutés à chaque lysat. Les lysats ont été incubés dans une roue rotative à 4°C o/n.

Les billes ont été culottées à 1000 rcf pendant 5 min et lavées avec 10 ml de tampon de lavage A et B (urée 8 M, Na2HPO4/NaH2PO4 0,1 M pH 8, Tris-HCL 10 mM pH 8,0, imidazole 10 mM pH 8 et β 5 mM -mercaptoéthanol) ensuite dans des tubes Falcon de 15 ml. Les billes ont ensuite été transférées dans des tubes Eppendorf de 1,5 ml à faible liaison (Sigma, Cat: Z666505) et lavées pendant 15 min sur une roue rotative à température ambiante (TA) avec du tampon de lavage C (urée 8 M, Na2HPO4 0,1 M/NaH2PO4 pH 6,3 , Tris-HCl 10 mM pH 6,3, imidazole 10 mM pH 7 et β-mercaptoéthanol 5 mM). Les billes ont ensuite été transférées dans de nouveaux tubes Eppendorf de 1,5 ml à faible liaison et lavées avec le tampon de lavage D (tampon de lavage C sans imidazole) pendant 15 min. Cette étape de lavage final a été répétée une fois de plus.

Les pulldowns utilisés pour WB ont été élués dans trois volumes de billes de tampon d'échantillon LDS (ThermoFisher Scientific, Cat: NP0007) additionné de dithiothréitol 100 mM (DTT) et d'imidazole 500 mM pH 7 en faisant bouillir à 99 ° C sur un agitateur à 1200 tr / min pendant 10 min.

Des pulldowns pour MS ont été préparés pour la digestion sur les billes en éliminant le tampon de lavage D et en remettant les billes en suspension dans un volume de billes de tampon de digestion (urée 7 M, Na2HPO4/NaH2PO4 0,1 M pH 7, Tris-HCL 10 mM pH 7, ABC 50 mM ). Les échantillons ont été additionnés de 1 mM de dithiothréitol (DTT) et incubés pendant 30 min sur un agitateur à 1200 tr/min à TA, puis additionnés de 5 mM de chloroacétamide (CAA) et incubés 30 min sur un agitateur à 1200 tr/min à TA, puis additionnés d'un DTT 5 mM supplémentaire (concentration finale de DTT 6 mM) et une autre incubation de 30 min sur un agitateur à 1200 tr/min à température ambiante. Lys-C (Wako, Cat : 129-02541) a été ajouté dans un rapport enzyme/protéine de 1:100, les échantillons ont été incubés sur un agitateur à 1200 tr/min à température ambiante o/n. Par la suite, trois volumes d'ABC 50 mM ont été ajoutés pour diluer l'urée à une concentration finale de 2 M. La trypsine (Promega, Cat : V5111) a été ajoutée dans un rapport enzyme/protéine de 1:100 et incubée sur un agitateur à 1 200 tr/min à RT o/n. Les peptides digérés ont été séparés des billes sur un filtre Ultrafree-MC de 0,45 µm, prélavé avec 50 mM d'ABC. Les peptides ont été dessalés et concentrés sur des embouts de platine constitués de 3 disques C18 empilés (Sigma, Cat : 66883-U) à l'aide d'un ensemble piston (Sigma, Cat : 26150) comme décrit précédemment80. Les peptides ont été élués avec 50 % d'acétonitrile (ACN) (Sigma, 34998) dans 0,1 % d'acide formique (Sigma, 09676). Les fractions éluées ont été séchées sous vide à l'aide d'un SpeedVac RC10.10 (Jouan) et dissoutes dans de l'acide formique à 0,1 % avant la chromatographie liquide en nanoflux en ligne et la spectrométrie de masse en tandem (nanoLC-MS/MS).

L'enrichissement et la spectrométrie de masse des UbiSites ont déjà été décrits28. En bref, les cellules U2OS ont été traitées avec du DMSO, 1 µM TAK243 (Active Biochem, Cat : A-1384), 10 µM MG132 (Sigma, Cat : C2211) ou 20 µM PR619 (Tebu-bio, Cat : SI9619) pendant 3 h puis lavé deux fois avec du PBS glacé, gratté et lysé. Les cellules ont été lysées dans un tampon de lyse (guanidine-HCL 8 M, bicarbonate d'ammonium 25 mM (ABC), pH 8,5), soniquées et centrifugées pendant 30 min à 15 000 rcf. Au total, 50 mg de protéine par échantillon (mesuré par BCA) ont été réduits avec 2 mM de DTT pendant 30 min à RT et alkylés avec 11 mM de CAA pendant 30 min à RT. Les échantillons ont été dilués avec 25 mM d'ABC à 2 M de guanidine-HCL et éliminés à travers un filtre PVDF de 0,45 µm (Millipore, Cat : SLHV033RS). Lys-C a été ajouté à un rapport enzyme sur protéine de 1:100 et incubé o/n à température ambiante. Les peptides digérés ont été purifiés par des cartouches C18 (Waters, Cat : WAT051910) et lyophilisés. Les peptides ont ensuite été dissous dans un tampon IP (50 mM MOPS pH 7,5, 10 mM phosphate de sodium, 50 mM NaCl) avec 0,1 % de Triton X-100. L'anticorps UbiSite conjugué et réticulé aux billes de protéine G a été ajouté aux peptides dissous et incubé pendant 5 h à 4 ° C (~ 100 µg d'anticorps UbiSite pour chaque 10 mg de matière première) (Sigma-Aldrich, Cat: MABS486). Les billes ont été lavées trois fois avec un tampon IP sans détergent et ensuite trois fois avec du NaCl 150 mM. Les peptides purifiés ont été élués avec 0,1 % de TFA trois fois 5 minutes d'incubation. Les peptides ont été neutralisés avec 1 M ABC, puis dilués à 25 mM ABC et soumis à une digestion à la trypsine o/n à 37 °C. Chaque échantillon a été soumis à un fractionnement à pH élevé en dissolvant les peptides dans le solvant A (hydroxyde d'ammonium 10 mM pH 10) et chargé sur des embouts de scène faits maison (deux disques de matériau C18 complétés par une couche de 0,5 cm de billes C18 de 1,9 µm (Dr. Maisch, Cat: r119.aq).Les pointes d'étape ont été activées avec du méthanol, lavées avec du Solvant B (hydroxyde d'ammonium 5 mM pH 10 et 50% ACN) équilibré deux fois avec du Solvant A. Les échantillons ont été fractionnés par élution par étapes d'hydroxyde d'ammonium 10 mM avec augmentation concentration d'ACN : 1,75 %, 2,75 %, 3,5 %, 4 %, 5 %, 5,5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10,5 %, 12 %, 14 %, 17,5 %, 25 %, 50 % et 80 %.

Les échantillons de réduction His10-Ub ont été exécutés sur un système EASY-nLC 1000 (Proxeon) connecté à un Q Exactive Orbitrap (ThermoFisher Scientific) via une source d'ions nano-électrospray, en utilisant Xcalibur (version 4.3) et Tune (version 2.9). Trois répétitions ont été réalisées pour le DMSO, le TAK243, le MG132, le PR619 et les échantillons parentaux, quatre répétitions pour les traitements combinés avec deux répétitions techniques pour la première répétition. Les peptides ont été séparés sur une colonne de silice fondue de 15 cm (MS Wil, FS360-75-15-N-5-C25) remplie en interne de billes C18 de 1,9 μm (Dr Maisch, Cat: r119.aq). La longueur du gradient était de 120 min de 2 % à 95 % d'acétonitrile dans 0,1 % d'acide formique à un débit de 200 nL/minute. Le spectromètre de masse a été utilisé en mode d'acquisition dépendant des données avec une méthode top 10. Les spectres MS à balayage complet ont été acquis à une valeur cible de 3 × 106 et une résolution de 70 000, et les spectres de masse en tandem à dissociation collisionnelle supérieure (HCD) (MS / MS) ont été enregistrés à une valeur cible de 1 × 105 et avec une résolution de 17 500 avec une énergie de collision normalisée (NCE) de 25 %. Les temps d'injection maximum de MS1 et MS2 étaient respectivement de 20 ms et 60 ms. Les masses d'ions précurseurs des ions scannés ont été dynamiquement exclues (DE) de l'analyse MS/MS pendant 60 s. Les ions de charge 1 et> 6 ont été exclus du déclenchement des événements MS2.

Les échantillons UbiSite pour l'acquisition dépendante des données (DDA) ont été séparés sur une colonne de silice fondue de 24 cm avec un diamètre intérieur de 75 µm emballée en interne avec des billes C18 de 1,9 μm (Dr. Maisch, Cat : r119.aq) par phase inverse chromatographie à l'aide d'un système ultra-haute pression EASY-nLC 1000 (ThermoFisher Scientific) connecté à un spectromètre de masse Q Exactive HF (ThermoFisher Scientific) équipé d'une source d'ions nano-électrospray (ThermoFisher Scientific), utilisant Xcalibur (version 4.3) et Tune (version 2.9). La colonne de silice a été chauffée à 50 °C avec un appareil fait maison. Les peptides ont été chargés dans le solvant A (0,5 % d'acide acétique) et élués en appliquant un gradient de solvant B (80 % d'ACN, 0,5 % d'acide acétique) de 7 % à 10 % de solvant B pendant 8 min, de 10 % à 33 % pendant 90 min, suivie d'une augmentation du solvant B à 45 % pendant 10 min et terminée par un passage à 98 % pendant 6 min à 250 nl/min. Le spectromètre de masse Q Exactive HF fonctionnait en mode polarité positive avec une température capillaire de 275 °C. Les données MS ont été acquises à l'aide d'une méthode dépendante des données commutant entre les événements de balayage complet et les 12 meilleurs balayages MS/MS. Une valeur cible de contrôle de gain automatique (AGC) a été définie sur 3 × 106 et la résolution a été définie sur 60 000 pour les événements de balayage MS complets avec une plage de balayage de 300 à 1 700 m/z et un temps d'injection d'ions (IT) maximal de 15 ms. Les précurseurs ont été fragmentés par dissociation collisionnelle à haute énergie (HCD) avec une énergie collisionnelle normalisée (NCE) de 28. Les scans MS / MS ont été acquis avec une résolution de 60 000, IT maximum de 110 ms, fenêtre d'isolement de 1, 2 m / z. Le séquençage répété des peptides a été empêché en réglant la fenêtre d'exclusion dynamique sur 20 s.

Les échantillons UbiSite pour les analyses MS d'acquisition indépendante des données (DIA) ont été préparés de la même manière que pour les expériences DDA à grande échelle, à l'exclusion du fractionnement HpH. Après digestion avec de la trypsine, les mélanges de peptides résultants de chaque échantillon ont été purifiés avec des Stage-Tips, complétés avec des peptides standard iRT (Biognosys AG, Suisse) et soumis à une analyse nanoLC-MS/MS à l'aide d'un EASY-nLC 1000 ultra-haute pression (Thermo Fisher Scientific) couplé en ligne avec le spectromètre de masse Orbitrap Exploris 480 (Thermo Fisher Scientific), utilisant Xcalibur (version 4.3) et Tune (version 3.0). Le chargement des peptides et les paramètres nanoLC étaient les mêmes que ceux décrits ci-dessus. Le temps d'acquisition des échantillons était de 120 min. Nous avons utilisé la méthodologie DIA avec les paramètres suivants : le balayage MS1 avec une plage de masse de 350 à 1 400 m/z avait une cible AGC normalisée définie sur 300 % avec une résolution de 120 000 et un temps d'injection de 45 ms. Pour l'acquisition des balayages DIA, la valeur cible AGC a été fixée à 1 000 %, R = 30 000 et IT à 54 ms. 50 fenêtres de 13 Da avec un recouvrement de 1 Da ont été utilisées. L'énergie de collision normalisée a été fixée à 28 %. Les données ont été acquises en mode profil en utilisant une polarité positive.

Les données MS générées à partir d'échantillons His10-Ub ont été analysées à l'aide de MaxQuant (version 1.6.14) correspondant au protéome humain (Uniprot, examiné le protéome d'Homo sapiens téléchargé le 22 juin 2020) avec les paramètres par défaut du filtrage des scores FDR et Andromeda, correspondant à une base de données leurre et les contaminants courants. La digestion a été réglée pour permettre quatre clivages manqués avec digestion à la trypsine. La normalisation a été effectuée par LFQ (paramètres par défaut) avec la correspondance entre les exécutions activée. La carbamidométhylation de la cystéine a été définie comme modification fixe et l'acétylation N-terminale, l'oxydation de la méthionine et la modification diGly sur la lysine ont été incluses comme modifications variables. La quantification des intensités peptidiques a été définie pour inclure les modifications diGly sur la lysine, mais pas pour éliminer les homologues non modifiés.

Les données MS générées à partir d'échantillons UbiSite ont été analysées comme décrit ci-dessus, mais avec une normalisation effectuée par LFQ définie sur un peptide unique minimum. Des recherches supplémentaires ont inclus des modifications variables de diGly sur les lysines, la protéine N-term et la phosphorylation de la sérine, de la thréonine et de la tyrosine. La quantification des intensités peptidiques a été définie pour inclure les modifications diGly sur les lysines, mais pas pour éliminer les homologues non modifiés.

Les fichiers de données brutes ont été traités par Spectronaut (version 15.2.210819.50606) avec l'option de recherche Direct DIA à l'aide du moteur de recherche intégré Pulsar et des paramètres suivants : nombre de clivages manquants à la trypsine défini sur 2, longueur minimale et maximale des peptides : 7 et 52 acides aminés. , respectivement. Les identifications de PSM, de peptides et de groupes de protéines FDR ont été fixées à 0,01. La base de données UniProt révisée (H. Sapiens, 10/2019, SwissProt) contenant 20 351 entrées a été utilisée pour la recherche. L'acétyle (protéine N-terme), le GlyGly (K), l'oxydation (M) ont été définis comme variables et le carbamidométhyle (C) comme modifications fixes. La stratégie de normalisation a été définie sur la normalisation globale avec la médiane et le filtrage des données définis sur la valeur Q. La quantification des peptides a été réalisée au niveau MS2.

Perseus (version 1.6.14) a été utilisé pour l'analyse des données81. Les contaminants courants et les accès à une base de données de leurres ont été filtrés. Un diagramme de Venn a été créé à partir du nombre total de sites identifiés (à partir de GlyGly.txt) dans trois répétitions, où le chevauchement entre les traitements contient l'identification dans au moins une répétition. Les données ont été transformées en log2 et filtrées pour l'identification dans les trois répétitions séparément pour chaque groupe de traitement (TAK243, MG132 et PR619) par rapport au contrôle (DMSO). Les valeurs manquantes ont été imputées à partir de l'extrémité inférieure de la distribution normale (paramètres par défaut). Un test t d'étudiant bilatéral avec FDR basé sur la permutation a été utilisé pour calculer la signification entre le traitement et le contrôle à 0, 05 FDR (valeur q) et S0 = 0, 1 (ensemble de données supplémentaire 4). La différence calculée entre le traitement et le contrôle (DMSO) a été utilisée comme facteur de changement par rapport au DMSO. Les identifiants Uniprot ont été utilisés pour cartographier les protéines identifiées dans les bases de données STRING ou BRENDA à l'aide de Cytoscape (3.8.2) ou Perseus (1.6.14) respectivement.

Python 3 (3.8.13) avec les packages Logomaker (version 0.8) et matplotlib (version 3.3.2) a été utilisé pour générer des logos de séquence à partir de sites Ub exclusivement significatifs (test t de Student bilatéral FDR = 0,05 S0 = 0,1) dans MG132, Pr619 ou TAK243 ont traité des échantillons UbiSite82. Les 15 acides aminés en amont ou en aval de la lysine modifiée diGly identifiée ont été utilisés pour générer des logos de séquence. Le logo de la séquence DMSO a été généré à partir de sites qui ont été identifiés dans les trois répétitions mais qui n'ont pas été appauvris ou enrichis de manière significative dans aucun traitement. Le changement de fréquence des fréquences d'acides aminés a été calculé en comparant le changement de fréquence du traitement MG132 ou PR619 au logo de la séquence DMSO.

La table de sortie large Spectronaut a été filtrée dans Perseus (1.6.14). Les données ont été transformées en log2 et filtrées pour identification dans les cinq répétitions d'au moins un groupe de traitement. Seuls les peptides avec une modification diGly dans sa fenêtre de séquence modifiée ont été conservés. Une analyse en composantes principales a été effectuée avec les paramètres par défaut. Les intensités ont été notées Z en soustrayant la moyenne et utilisées pour le regroupement hiérarchique par distance euclidienne (prétraité avec k-means, 300 clusters, 1000 itérations). Les valeurs manquantes ont été imputées à partir de l'extrémité inférieure de la distribution normale (paramètres par défaut). Un test t d'étudiant bilatéral avec FDR basé sur la permutation a été utilisé pour calculer la signification entre le traitement et le contrôle à 0, 05 FDR (valeur q) et S0 = 0, 1 (ensemble de données supplémentaire 5).

L'analyse a été effectuée sur le fichier ProteinGroups.txt. Les contaminants courants, les accès à une base de données de leurres et les peptides identifiés uniquement par site ont été filtrés. Les données ont été transformées en log2 et filtrées pour identification dans au moins trois répétitions séparément pour les groupes de traitement TAK243, MG132, PR619, TAK243 + MG132, TAK243 + PR619 et MG132 + PR619 avec DMSO et parental (U2OS tous les traitements). Les valeurs manquantes ont été imputées à partir de l'extrémité inférieure de la distribution normale (par défaut). Un test t d'étudiant bidirectionnel à droite a été effectué pour filtrer les protéines considérablement enrichies dans les échantillons His10 par rapport aux échantillons parentaux U2OS à la valeur p 0, 05 (substrats His10-Ub). Ensuite, un test t d'étudiant bidirectionnel avec FDR basé sur la permutation a été utilisé pour calculer la signification et la différence entre le traitement/le point temporel et le contrôle (DMSO) à 0,05 FDR S0 = 0,1 (valeur q) (ensemble de données supplémentaire 6). Les données ont été représentées sous forme de figures à l'aide de Perseus (1.6.14), Graphpad Prism (8.4.2), Python 3 (3.8.13), Illustrator (25.2.3) et Photoshop (22.4.1).

Cytoscape (3.8.2) avec les applications MCODE (2.0.0) et STRING (seuil de confiance de l'interaction protéine-protéine = 0,9) a été utilisé pour créer des réseaux d'interaction à partir des identifiants de gènes Uniprot à partir des données UbiSite. Des sous-grappes de protéines hautement interconnectées ont été générées avec MCODE (paramètres par défaut) et un enrichissement fonctionnel a été obtenu à partir de STRING avec le protéome humain en arrière-plan. La dynamique des sites Ub individuels en réponse à MG132 et PR619 a été visualisée sur chaque nœud à l'aide de l'application Omics Visualizer (1.3.0) pour Cytoscape (3.8.2)83. Un réseau comprenant PARP1 a été généré de la même manière mais avec un seuil de confiance STRING à 0,7.

La fenêtre de séquence de 15 AA en amont et en aval des 100 sites diGly les plus enrichis dans les données UbiSite pour les échantillons traités avec PR619 ou MG132, avec une différence inférieure à un facteur dans l'autre traitement, a été analysée pour l'accessibilité de surface avec NetSurfP - 2.084. Des séquences randomisées de 31 AA ont été générées à l'aide de The Sequence Manipulation Suite85. La fenêtre de séquence de 15 AA en amont et en aval des 100 sites diGly les plus enrichis dans les données UbiSite pour les échantillons traités avec PR619 ou MG132, avec une différence inférieure à un facteur dans l'autre traitement, a été analysée pour l'accessibilité de surface avec NetSurfP - 2.084. Des séquences randomisées de 31 AA ont été générées à l'aide de The Sequence Manipulation Suite85.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données de protéomique de spectrométrie de masse ont été déposées auprès du Consortium ProteomeXchange via le référentiel partenaire PRIDE avec l'identifiant de jeu de données PXD027330 pour His10-Ub et PXD027328 pour les données UbiSite DDA et PXD030644 pour les données UbiSite DIA86. La base de données Uniprot est disponible sur www.uniprot.org. La base de données des enzymes Brenda est disponible sur www.brenda-enzymes.org. PhosphoSitePlus est disponible sur www.phosphosite.org. la base de données STRING est disponible sur www.string-db.org. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous remercions le Dr R. González-Prieto pour son aide avec la spectrométrie de masse et LA Claessens pour la relecture du manuscrit. Ce projet a reçu un financement du programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 de l'Union européenne dans le cadre de la convention de subvention Marie Skłodowska-Curie n° 765445. Le travail a également été soutenu en partie par la Fondation nationale danoise pour la recherche (subvention DNRF n° 141 à ATLAS), Independent Research Fund Denmark (DFF—8022-00051) et l'infrastructure de recherche INTEGRA financée par la Novo Nordisk Foundation. Ce travail a été soutenu par la subvention à la découverte (RGPIN 2016-05868) du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada à GMS.

Ces auteurs ont contribué à parts égales: Fredrik Trulsson, Vyacheslav Akimov.

Ces auteurs ont supervisé conjointement ce travail : Blagoy Blagoev, Alfred CO Vertegaal.

Biologie cellulaire et chimique, Centre médical universitaire de Leiden, Leiden, Pays-Bas

Fredrik Trulsson, Nila van Overbeek, David Aureliano Pérez Berrocal & Alfred CO Vertegaal

Département de biochimie et de biologie moléculaire, Université du Danemark du Sud, Odense, Danemark

Viatcheslav Akimov et Blagoy Blagoev

Laboratoire de recherche sur le cancer de la peau, Centre de recherche du CHU de Québec, Centre de recherche du CHU Laval, Québec, QC, Canada

Mihaela Robu, Rashmi G. Shah et Girish M. Shah

Groupe de recherche en biochimie des systèmes informatiques, Institut Max-Planck de biochimie, Martinsried, Allemagne

Jürgen Cox

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FT et ACOV ont conçu le projet, conçu des expériences et rédigé le manuscrit, avec la contribution de tous les autres auteurs. FT et VA ont effectué l'écran UbiSite, supervisé par BB et ACOVFT ont effectué l'écran His10-Ub, supervisé par ACOVNO a effectué la purification His10-Ub pour l'immunotransfert, supervisé par ACOVFT et VA a opéré les spectromètres de masse. FT a analysé les données et fait les chiffres. DPB a préparé la sonde de protéasome. MR et RS ont effectué des tests PARP1, supervisés par le GSJC et ont fourni une contribution scientifique. L'ACOV a initié le projet et obtenu un financement.

Correspondance à Blagoy Blagoev ou Alfred CO Vertegaal.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent. UbiSite est breveté par l'Université du Danemark du Sud (numéro de brevet US9476888B2).

Nature Communications remercie Jeroen Demmers et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Trulsson, F., Akimov, V., Robu, M. et al. Les enzymes de désubiquitination et le protéasome régulent des ensembles préférentiels de substrats d'ubiquitine. Nat Commun 13, 2736 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30376-7

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Reçu : 16 août 2021

Accepté : 27 avril 2022

Publié: 18 mai 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-30376-7

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