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Jun 11, 2023

Biologie des communications volume 5, Numéro d'article : 1301 (2022) Citer cet article

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Le TGFβ1 joue un rôle régulateur dans la détermination du devenir des cellules rénales et de la progression de la fibrose rénale. Ici, nous montrons une association entre SMAD3 et l'histone méthyltransférase, EZH2, au cours de la différenciation cellulaire ; ChIP-seq a révélé que SMAD3 et EZH2 co-occupent le génome dans les iPSC et dans les progéniteurs de néphrons dérivés d'iPSC. Grâce à l'intégration de l'expression génique unicellulaire et du profilage de l'épigénome, nous avons identifié de novo des myofibroblastes ACTA2 + ve / POSTN + ve dans des organoïdes rénaux traités avec TGFβ1, caractérisés par une accessibilité accrue de la chromatine cis dépendante de SMAD3 et une expression génique associée à l'activation des fibroblastes. Nous avons identifié des régulons associés à la fibrose caractérisés par un enrichissement en SMAD3, AP1, la famille des facteurs de transcription ETS, et NUAK1, CREB3L1 et RARG, correspondant à des motifs enrichis au niveau de loci accessibles identifiés par scATACseq. Le traitement avec l'inhibiteur spécifique d'EZH2 GSK343 ​​a bloqué la co-accessibilité cis dépendante de SMAD3 et inhibé l'activation des myofibroblastes. Ce mécanisme, par lequel le TGFβ signale directement à la chromatine, représente un déterminant critique des états fibrotiques différenciés.

Le facteur de croissance transformant bêta (TGFβ) est un régulateur multifonctionnel, impliqué de manière centrale dans l'homéostasie normale ainsi que dans la souche et la régénération. La dérégulation de la signalisation TGFβ est impliquée dans plusieurs maladies et pathologies inflammatoires ; notamment dans le contexte de la fibrose rénale, le TGFβ1 joue un rôle central en tant que facteur pro-fibrotique et joue un rôle central dans le développement et la progression de l'insuffisance rénale terminale. La signalisation TGFβ1 et SMAD2/3 est augmentée dans plusieurs modèles animaux expérimentaux1 et chez les patients atteints de maladie rénale2 et son potentiel thérapeutique confirmé en tant qu'anticorps neutralisants et oligodésoxynucléotides antisens contre le TGFβ et ses récepteurs atténuent les réponses fibrotiques dans plusieurs modèles3,4,5,6.

L'activation transcriptionnelle est au cœur des processus régulant le destin des cellules rénales et est modulée par l'accessibilité de la chromatine aux locus régulateurs tels que les promoteurs et les activateurs. Des approches à l'échelle du génome, telles que DNA-seq et ATAC-seq, cartographiant les changements dynamiques de l'accessibilité de la chromatine lors de la reprogrammation des cellules souches pluripotentes induites (iPSC), ont identifié que l'occupation des nucléosomes et les régions ouvertes de la chromatine sont modifiées de manière dynamique dans les régions régulatrices, en particulier au sites de liaison pour la reprogrammation des facteurs de transcription7,8. Les mécanismes épigénétiques qui contribuent à la différenciation et à la maturation cellulaires au cours du développement des organes et en réponse aux états métaboliques altérés dans la maladie font l'objet d'investigations intenses, car cela est largement reconnu comme une étape cruciale vers l'avancement des thérapies régénératives. Au centre de ce processus se trouve le complexe répressif polycomb 2 (PRC2), un complexe de remodelage de la chromatine qui médie le silence de l'expression génique, mais l'identification des éléments de réponse polycomb reste insaisissable9. Nous avons récemment identifié une interaction entre SMAD3 et EZH2 au cours de la différenciation des cellules souches10 qui, selon nous, joue un rôle clé dans la régulation de l'accès à la chromatine dans le microenvironnement compromis du rein fibrotique.

La prévalence de SMAD3 et EZH2 au niveau des enhancers et des superenhancers suggère fortement un rôle dans la modulation de l'accès à la chromatine. Les suramplificateurs sous-tendent l'identité, l'engagement de la lignée et la plasticité des cellules souches in vivo et sont susceptibles d'être impliqués de manière centrale dans la détermination du destin cellulaire où il a été suggéré qu'ils sont soumis à un "super-silence", marqué par la perte de H3K27ac et un gain de H3K27me311. Il est important de noter que la dynamique des amplificateurs et des superamplificateurs lors de la détermination du devenir, par exemple lors de la réparation des plaies ou de l'acquisition de la plasticité, est particulièrement sensible à leur microenvironnement et reflète ainsi la mémoire métabolique. Le couplage des facteurs déterminants de la lignée avec SMAD3 et EZH2 à ces régions régulatrices est donc susceptible d'influencer la dynamique de la chromatine nécessaire aux transitions phénotypiques dans de multiples contextes. Des percées récentes mettent en évidence la remarquable capacité d'auto-organisation des cellules souches pluripotentes à former des organoïdes rénaux en tant que plate-forme pour des études fonctionnelles et interrogatives de la fonction des gènes dans le développement et la maladie.

Ici, nous utilisons des organoïdes rénaux dérivés d'iPSC pour établir un modèle de différenciation cellulaire dans la fibrose rénale. À l'aide d'une analyse monocellulaire multimodale, nous montrons que le traitement des organoïdes avec TGFβ1 induit une différenciation des fibroblastes résidents en myofibroblastes, qui s'accompagne d'une expression accrue des gènes associés à la fibrose et de modifications de l'accessibilité de la chromatine. L'inhibition de l'expression du gène fibrotique atténué par EZH2 et les changements induits par le TGFβ1 dans l'accessibilité de la chromatine. Les résultats de cette étude indiquent que la manipulation de l'association entre SMAD3 et EZH2 peut être une stratégie thérapeutique utile pour la résolution de la fibrose rénale.

Ayant précédemment identifié une association entre SMAD3 et EZH2 dans plusieurs contextes10,12, nous avons d'abord étudié la localisation à l'échelle du génome de SMAD3 et du composant principal de PRC2, EZH2, dans les iPSC humaines et dans les populations de cellules progénitrices du néphron (NPC) dérivées d'iPSC à l'aide de ChIP -séq. L'expérience est résumée sous forme de schéma sur la figure 1a. Les iPSC ont été confirmés comme pluripotents, exprimant OCT4 ; les cellules ont été différenciées pendant une semaine selon 13 et étaient positives pour le marqueur de strie primitif, T / Brachury, après 3 jours de différenciation (Fig. 1b). Au jour 7, les cellules étaient négatives pour OCT4 et T, tout en exprimant des marqueurs de néphrogenèse précoce tels que HOXD11 et PAX2 (Fig. 1b). L'expression d'EZH2 a été maintenue pendant la différenciation, tandis que SMAD3 a augmenté pendant la différenciation, ce qui coïncide avec l'augmentation de H3K4me3 et H3K27me3 (Fig. 1c). ChIP-seq a identifié 971 pics SMAD3 et 8228 pics EZH2 au jour 0, et 2416 pics SMAD3 et 1912 pics EZH2 au jour 7. Plus de 70% des pics SMAD3 au jour 0 étaient situés dans des régions régulatrices intergéniques ou distales. Des données similaires ont été observées pour EZH2. Au jour 7, 2416 pics SMAD3 et 1912 pics EZH2 étaient apparents avec une distribution génomique globalement similaire (Fig. 1 supplémentaire). SMAD3 co-occupe le génome avec une variété de destins spécifiant les facteurs maîtres de transcription14. Dans les cellules souches, OCT4 est un gène cible SMAD3 et ensemble, ils forment un circuit de régulation pour réguler l'auto-renouvellement ; Les pics SMAD3 étaient apparents dans les iPSC dans la région activatrice de régulation cis du locus POU5F1, codant pour OCT4 (Fig. 1 supplémentaire).

a Les iPSC ont été différenciés en progéniteurs de néphron en utilisant des protocoles établis. Des échantillons pour ChIP-seq ont été prélevés au jour 0 et au jour 7 de la différenciation. b Immunomarquage de OCT4, T/Brachury, HOXD11 et PAX2 aux jours 0, 3 et 7. Grossissement, ×40. Échelle 50 µm. Les images sont représentatives de trois expériences indépendantes. c. Western blots montrant l'expression de EZH2, SMAD3, SMAD3 phosphorylé, H3K4me3, H3K27me3 et β-actine au cours de la spécification néphrogénique. Les transferts sont représentatifs de 3 expériences indépendantes. d SMAD3 et EZH2 co-occupent le génome dans les CSPi. Les graphiques de liaison montrent l'emplacement des sites liés à SMAD3 (gauche) et EZH2 (droite) par rapport à 971 sites liés à SMAD3. Pour chaque site lié à SMAD3 (axe y), la présence des sites SMAD3 (bleu) et EZH2 (gris) est affichée dans une fenêtre de 10 kb centrée sur le site lié à SMAD3. L'intensité à la position 0 indique que les sites se chevauchent. e Diagramme de Venn illustrant le nombre de loci liés SMAD3 et EZH2 dans les iPSC. f Motifs enrichis et sites chevauchants SMAD3 et EZH2 dans les iPSC. g. SMAD3 et EZH2 co-occupent le génome des PNJ. Les graphiques de liaison montrent l'emplacement des sites liés à SMAD3 (gauche) et EZH2 (droite) par rapport à 2416 sites liés à SMAD3. h Diagramme de Venn illustrant le nombre de loci liés SMAD3 et EZH2 dans les PNJ. i Motifs enrichis aux sites de chevauchement SMAD3 et EZH2 dans les iPSC.

Nous avons en outre observé que SMAD3 et EZH2 se lient à des sites similaires à travers le génome, confirmant leur association (Fig. 1d, g). 656 pics SMAD3 (67, 46%) se chevauchent directement avec les pics EZH2 dans iPSCS (Fig. 1e) tandis que 574 (23, 76%) se chevauchent dans les PNJ (Fig. 1h). L'annotation génomique des sites de liaison qui se chevauchent a révélé que la plupart des pics se trouvaient dans des régions régulatrices intergéniques ou distales (Fig. 1 supplémentaire). En utilisant les données ChromHMM des H1-ESC et du rein fœtal, nous avons constaté que les régions qui se chevauchent dans les CSPi et les PNJ étaient principalement enrichies en hétérochromatine et en régions réprimées (Fig. 1 supplémentaire). L'analyse des motifs a révélé un enrichissement des facteurs de transcription TFAP2A, TCF7 et BACH2 / BACH1 dans les iPSC (Fig. 1f) et TCF7, PBX1 et FOXC2 dans les PNJ (Fig. 1i). Les régions des deux jours étaient normalement enrichies en élément de liaison SMAD (Fig. 1f, i). Au jour 7, un nombre similaire de sites co-occupés SMAD3 et EZH2 était apparent (Fig. 1b supplémentaire), mais nous avons trouvé moins de sites liés à EZH2 dans la population de progéniteurs différenciés par rapport aux iPSC, avec une augmentation concomitante des sites liés à SMAD3, probablement reflétant la liaison de SMAD3 aux promoteurs et amplificateurs ouverts dans les cellules différenciées.

L'hétérogénéité complexe des organoïdes rénaux dérivés d'iPSC a conduit à leur proposition en tant que modèle attrayant pour de nombreux aspects de la maladie rénale. Pour générer des organoïdes rénaux pour modéliser les réponses TGFβ, nous avons adapté le protocole de 13 (Fig. 2a supplémentaire). La caractérisation des organoïdes rénaux par immunocytochimie et microscopie électronique à transmission est décrite dans la Fig. 2 supplémentaire et est comparable à d'autres organoïdes rénaux publiés13. Nous avons effectué un séquençage d'ARN unicellulaire (scRNAseq) pour valider et caractériser de manière transcriptionnelle les populations hétérogènes de cellules au sein d'organoïdes témoins et celles traitées avec TGFβ1. Pour identifier les types de cellules au sein de chacun des organoïdes, des grappes de l'organoïde témoin ont été utilisées pour l'annotation (Fig. 3a, b supplémentaire) et les principaux gènes exprimés de manière différentielle de chaque grappe ont été comparés à des marqueurs connus du rein en développement15,16,17 ainsi que des gènes marqueurs de protocoles d'organoïdes rénaux publiés18,19,20,21 et de l'Atlas de la néphrogénèse humaine22 (données supplémentaires 1 et 2). Nous avons observé certaines populations de cellules non rénales dans l'organoïde, conformément aux données unicellulaires d'organoïdes rénaux générées à l'aide du protocole Takasato18,19. L'analyse de la vitesse de l'ARN et de la trajectoire basée sur Phate a révélé que le groupe 3 (progéniteurs de Nephron) était très probablement le groupe parental de cellules pour le groupe 0 (fibroblaste 1 ; Fib1), le groupe PDGFRA+ve 1 (fibroblaste 2 ; Fib2) et le groupe 2 (Fibroblaste proliférant) (Fig. 3c supplémentaire). De plus, le cluster 5 (Podocyte/SSB/PT) provient en partie de ces trois clusters. La population de progéniteurs musculaires (cluster 10) provenait d'une partie du cluster 0 (stroma 1 ; S1).

Pour identifier les types de cellules dans les organoïdes traités au TGFβ1, 4057 cellules ont été intégrées et regroupées avec l'organoïde non traité. Deux populations distinctes ont été induites par le TGFβ1 (Fig. 2d), dont l'une présente des similitudes avec les données unicellulaires des populations de péricytes et de myofibroblastes suggérées par d'autres23 comme principales sources de production de matrice dans l'insuffisance rénale chronique (Fig. 4a supplémentaire, Données supplémentaires 3). Le groupe 2 (POSTN + ve, PDGFRA + ve, PDGFRB + ve, ACTA2 + ve) s'identifie facilement comme des myofibroblastes activés alors que la deuxième population, le groupe 3 (VIM + ve, COL1A1 + ve, PDGFRA - ve, ACTA2 + ve) était moins facilement identifiable mais l'expression de VIM et COL1A1 indiquait que ces cellules appartenaient à une lignée stromale (Fig. 2e et Fig. 4b supplémentaire). Fait intéressant, le TGFβ1 a également induit l'expansion d'une population de cellules de type épithélial (Kidney Progenitor 2) en grappe de 34, 3% (Fig. 2d); ces cellules ne semblaient pas proliférer activement et ne présentaient aucun signe de transition épithéliale à mésenchymateuse.

une projection UMAP de 8176 cellules individuelles (4119 témoins / 4057 TGFβ1) révélant 17 grappes distinctes dans des organoïdes rénaux dérivés d'iPSC, y compris de nouvelles populations distinctes de cellules stromales et musculaires en réponse au TGFβ1. Chaque point représente une seule cellule, codée par couleur pour le contrôle (rouge) et TGFβ1 (rouge). b Carte de vitesse d'ARN illustrant les trajectoires modifiées des cellules dans l'organoïde en réponse au TGFβ1. Les flèches longues correspondent à des changements dans l'expression des gènes et sont en cours de différenciation tandis que les flèches courtes représentent des cellules différenciées en phase terminale. c Arbre de clusters illustrant les relations entre les nouveaux clusters. d Trois nouvelles populations de cellules sont apparues en réponse au TGFβ1 et annotées MFib1, S1 et Kp2, correspondant à la différenciation des populations de type myofibroblaste et épithéliales, respectivement. e Expression de PDGFRA, PDGFRB, POSTN, ACTA2 et OGN dans Fib1-2 et MFib1, et S1. f Carte thermique des gènes marqueurs sélectionnés utilisés pour annoter les clusters MFib1 et S1. g Cell Phate Map illustrant les trajectoires du destin de Fib 1, Fib 2, MFib1 et S1 dans l'organoïde. h Arbre de lignée des amas de fibroblastes et de stroma en réponse au TGFβ1.

Le cluster PDGFRA + ve Myofibroblast 1 (MFib1) était marqué par l'expression accrue de la périostine (POSTN), de la transgéline (TAGLN), de la fibronectine (FN1) et de l'actine α-musculaire lisse (ACTA2), indiquant que ce cluster était principalement composé de myofibroblastes -comme les cellules23. Le cluster S1 était marqué par une expression accrue de FST, LEFTY2, ADAMTS6, OGN et SULF2. Les deux groupes exprimaient plusieurs gènes communs, notamment plusieurs protéines de la matrice extracellulaire (ECM) associées à la fibrose, notamment FN1, COL1A1, COL1A2, COL3A1, COL22A1 et l'enzyme de réticulation du collagène LOX (Données supplémentaires 1) ainsi que les gènes de fibroblastes CALD1, PALLD, NCAM1 (Fig. 4b supplémentaire). Les cellules des deux groupes étaient négatives pour les gènes du muscle lisse, CNN1 et MYH11 (Fig. 4c supplémentaire). L'analyse de tous les gènes marqueurs dans les organoïdes témoins et traités au TGFβ1 a révélé une similitude frappante avec Fib1 et Fib2, suggérant que ces cellules s'étaient différenciées en réponse au TGFβ1 (Fig. 2c, f); Les trajectoires de Phate et l'analyse de la vitesse de l'ARN ont également suggéré que Fib2 était le cluster parent de MFib1 tandis que Fib1 était le cluster parent de S1 (Fig. 2b, c, g, h). Les scores du gène cible TGFβ et du gène central du matrisome étaient significativement plus élevés dans les clusters MFib1 et S1 (Fig. 5a, b supplémentaires).

L'analyse de l'expression génique différentielle (DEG) a été effectuée pour comprendre la variation entre les grappes stromales nouvellement formées et leurs grappes parentales. 491 gènes ont été augmentés dans MFib1 par rapport à son groupe parent Fib2 (Données supplémentaires 4) ; 349 gènes ont été significativement augmentés dans S1 par rapport à son cluster parent Fib1. En réponse au TGFβ1, MFib1 et S1 avaient une expression accrue d'ACTA2, POSTN, FN1, FST, TAGLN, SCX, CDH2, OGN et de plusieurs collagènes (Fig. 3a – c et données supplémentaires 4). L'expression de OGN, COL22A1, TAGLN, FIBIN, RGCC, ACTG2 et ACTA2 était exclusive aux nouveaux clusters et sont des gènes marqueurs généralement acceptés de la transition fibroblaste à myofibroblaste23,24,25 (Fig. 3c, g). Il convient de noter que l'immunofluorescence a confirmé une augmentation significative de la coloration de l'αSMA et de la périostine dans les cellules interstitielles / stromales en réponse au TGFβ1 (Fig. 3d – f). De plus, une coloration rouge picrosirius élevée a été observée en réponse au TGFβ1 (Fig. 6a, b supplémentaires). Plusieurs gènes associés aux myofibroblastes étaient également fortement exprimés dans MFib1 par rapport à Fib1-2 et S1, tels que POSTN, FGF18, MGP et BGN (Fig. 7a supplémentaire). Les cartes de réseaux de protéines pour les gènes régulés positivement de manière différentielle dans MFib1 ont révélé un réseau d'interaction protéine-protéine (PPI) étroit associé de manière significative aux processus biologiques de l'organisation de la MEC, du développement des organes et de la morphogenèse (Fig. 7b supplémentaire). Dans S1, l'expression de LEFTY2, PAX7, DLK1 et SYT6 a été observée par rapport aux autres clusters stromaux (Fig. 7c supplémentaire). Les IPP pour les gènes différentiellement régulés à la hausse dans S1 étaient significativement associés aux processus de développement et à la différenciation cellulaire (Fig. 7d supplémentaire).

a UMAP de gènes différentiellement régulés positivement dans les organoïdes traités au TGFβ1. b Expression à l'échelle des collagènes dans Fib1-2 et MFib1, et S1. c Graphiques en violon de gènes exprimés de manière différentielle dans MFib1 et S1 par rapport aux populations parentales Fib1-2. d Les organoïdes ont été traités avec du TGFβ1 pendant 48 h. TGFβ1 a induit l'expression de l'actine musculaire lisse (αSMA) et de la périostine (POSTN) dans les organoïdes rénaux par rapport au contrôle Barre d'échelle : Contrôle, 200 µm, TGFβ1, 150 µm. Les images sont représentatives de trois expériences indépendantes. e zone αSMA/DAPI et f zone POSTN/DAPI dans des organoïdes non traités ou traités au TGFβ1. Chaque symbole représente la moyenne de 18 champs imagés au hasard, tirés d'un organoïde par condition, à partir de trois expériences indépendantes. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. *P ≤ 0,01, **P ≤ 0,0015. g Tracés d'analyse de trajectoire unicellulaire des changements d'expression génique pour ACTA2, FN1, COL22A1, COL1A1 et POSTN dans Fib2 et MFib1. Les cellules sont colorées par le pseudo-temps.

L'analyse de l'expression différentielle a également révélé que 112 gènes étaient régulés à la baisse dans MFib1 par rapport à Fib2 et ces gènes comprenaient ID3, ID1, NR2F1 et VEGFD (Fig. 8a supplémentaire). Dans S1, 176 gènes étaient régulés négativement de manière différentielle par rapport à Fib1 et ces gènes comprenaient MET, EDN3, IGDCC3 et ST1 (Fig. 8c supplémentaire). Les IPP pour les gènes régulés négativement de manière différentielle dans MFib1 et S1 en réponse au TGFβ1 ont été enrichis pour les termes GO associés à la réplication de l'ADN, aux processus de biosynthèse des substances organiques et au développement épithélial (Fig. 8c, d supplémentaires). En résumé, le traitement par TGFβ1 des organoïdes rénaux induit la différenciation des amas stromaux, l'activation des fibroblastes et stimule la transition fibroblaste-myofibroblaste.

Ensuite, nous avons cherché à évaluer si les gènes régulés positivement en réponse au TGFβ1 étaient également associés à la fibrose rénale. Les gènes régulés positivement dans MFib1 et S1 en réponse au TGFβ1 ont été comparés aux données de séquençage d'ARN en vrac accessibles au public provenant du tubulointerstitium de donneurs vivants en bonne santé (n = 9) et de patients atteints de fibrose rénale (n = 10 ; www.nephroseq.org). Une baisse significative du taux de filtration glomérulaire (DFG) a confirmé que les patients avaient développé une maladie rénale (Fig. 9a supplémentaire). Une grande proportion de DEG régulés à la hausse ont également augmenté de manière significative dans le rein fibrotique (n = 10) par rapport au témoin vivant en bonne santé (n = 9; Fig. 9a, b supplémentaires). Cela indique que le traitement par TGFβ1 des organoïdes rénaux induit une réponse fibrotique similaire à celle observée in vivo.

Les preuves actuelles suggèrent que EZH2 régule probablement l'activation de la transcription du gène fibrogène en interagissant avec la voie de signalisation TGFβ126,27,28,29. Compte tenu de nos observations précédentes sur SMAD3 et EZH2, nous avons émis l'hypothèse que le ciblage de cette interaction pourrait modifier la réponse des populations stromales au TGFβ1. Les organoïdes rénaux ont été traités avec l'inhibiteur EZH2 compétitif sélectif et très puissant de la S-adénosyl-L-méthionine, GSK34330. Nous avons cartographié le transcriptome unicellulaire des organoïdes rénaux traités avec GSK343 ​​et TGFβ1. Au cours du traitement, des cellules de faible qualité ont été supprimées et 3 584 cellules pour GSK343 ​​et 3 823 cellules pour TGFβ1 + GSK343 ​​ont été intégrées et regroupées avec les organoïdes témoins et TGFβ1 comme décrit précédemment. Les organoïdes rénaux traités avec GSK343 ​​seul ont servi de contrôle et l'analyse d'une seule cellule a révélé que ces organoïdes étaient très similaires aux organoïdes témoins, sans différenciation cellulaire apparente ni modification significative du nombre de cellules par grappe (Fig. 4a, b). Les grappes dans les organoïdes TGFβ1 + GSK343 ​​correspondaient très bien à TGFβ1 et le nombre et la proportion de cellules dans chaque grappe étaient extrêmement similaires (Fig. 4a, b). De plus, la prolifération du cluster Kidney Progenitor 2 était également évidente dans les organoïdes TGFβ1 + GSK343. Au niveau de l'expression génique, le prétraitement des organoïdes avec GSK343 ​​avant le traitement au TGFβ1 n'a pas modifié l'identité des clusters MFib1 et S1 (Fig. 4a, c); cependant, la régulation à la baisse de plusieurs gènes associés aux myofibroblastes (ACTA2, POSTN, COL4A1 et SULF2) dans le cluster PDGFRA + ve MFib1 était apparente (Fig. 4c). De plus, l'analyse par immunofluorescence a révélé qu'un prétraitement avec GSK343 ​​supprimait l'expression accrue d'αSMA et de périostine dans les cellules interstitielles / stromales des organoïdes rénaux en réponse au TGFβ1 (Fig. 4d – f). Dans l'ensemble, nous montrons que l'inhibition de EZH2 dans les organoïdes rénaux atténue l'expression des gènes associés à la fibrose rénale.

a UMAP intégré des données scRNAseq pour toutes les conditions. b Diagramme à barres illustrant le pourcentage de cellules par grappe dans chaque échantillon. c Expression génique à l'échelle pour MFib1 dans les organoïdes témoins, TGFβ1 et TGFβ1 + GSK343. d Les organoïdes ont été prétraités avec l'inhibiteur EZH2 GSK343 ​​pendant 1 h avant le traitement avec TGFβ1 pendant 48 h. Immunomarquage de l'αSMA et de la périostine (POSTN) dans les organoïdes traités au TGFβ1− et au TGFβ1 + GSK343. Barre d'échelle 150 µm. Les images sont représentatives de trois expériences indépendantes. e zone αSMA/DAPI et f zone POSTN/DAPI dans les organoïdes traités par TGFβ1 et TGFβ1 + GSK343. Chaque symbole représente la moyenne de 18 champs imagés au hasard, tirés d'un organoïde par condition, à partir de trois expériences indépendantes. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. **P ≤ 0,01 (zone αSMA/DAPI = P ≤ 0,0083 ; zone POSTN/DAPI = P ≤ 0,0017).

Les réponses transcriptionnelles au TGFβ1 sont dans une large mesure façonnées par l'interaction des protéines SMAD activées avec la chromatine. Les membres de la superfamille TGFβ exercent leur contrôle transcriptionnel en partie par la régulation de l'activité de l'amplificateur et par l'interaction directe des complexes SMAD avec les promoteurs. Pour sonder davantage la relation entre TGFβ1 et EZH2 au niveau de la chromatine, nous avons utilisé l'ATAC-seq à cellule unique (scATACseq) pour cartographier l'accessibilité du génome dans les cellules stromales pendant la transition fibroblaste-myofibroblaste dans les organoïdes dérivés d'iPSC exposés au TGFβ1 en présence ou absence de GSK343.

À l'aide de l'intégration multimodale, nous avons caractérisé les types de cellules présentes dans notre ensemble de données scATACseq en comparant les profils d'accessibilité de la chromatine à l'expression des gènes. En bref, pour interpréter les clusters scATACseq, nous avons utilisé l'ensemble de données scRNAseq annoté pour prédire les types de cellules présentes dans l'ensemble de données scATACseq. L'annotation des clusters scATACseq a été réalisée en créant une matrice d'activité génique à l'aide d'une mesure de l'accessibilité de la chromatine dans le corps du gène et du promoteur des gènes codant pour les protéines. Un ensemble d'ancres d'intégration a été identifié entre l'ensemble de données scRNAseq et la matrice d'activité génique, ce qui a permis la prédiction et l'attribution des types de cellules dans l'ensemble de données scATACseq. Après l'intégration, les étiquettes ont été transférées des clusters annotés dans l'ensemble de données scRNAseq aux clusters prédits dans l'ensemble de données scATACseq (Fig. 5a); L'activité génique au niveau des promoteurs était généralement un prédicteur fiable de l'expression génique (Fig. 10a, b supplémentaire) et les gènes marqueurs clés choisis pour l'annotation des clusters partageaient des modèles de corrélation entre les ensembles de données.

une stratégie d'intégration multi-omique pour le traitement de l'ensemble de données scATACseq. Des grappes annotées dans l'ensemble de données scRNAseq ont été utilisées pour prédire les types de cellules dans l'ensemble de données scATACseq. Graphique UMAP de l'ensemble de données scATACseq avec des affectations de type cellulaire basées sur l'activité génique. b Modifications globales de l'accessibilité de la chromatine au niveau du site de début de transcription (TSS), des promoteurs, des activateurs et des sites d'hypersensibilité à la DNase I. ****P ≤ 0,0001, test t par paire avec correction de Bonferroni. c Les modifications de l'accessibilité de la chromatine au niveau du site de début de transcription (TSS), des promoteurs, des activateurs et des sites d'hypersensibilité à la DNase I en réponse au TGFβ1 dans Fib2 et MFib1 sont inhibées par GSK343. **P ≤ 0,01 ; ***P ≤ 0,001 ; ****P ≤ 0,0001 ; test t par paires avec correction de Bonferroni. d Prédiction des réseaux de co-accessibilité cis (CCAN) aux loci de l'échantillon en réponse à TGFβ1 et GSK343. Un score de co-accessibilité plus élevé (rouge) indique une co-accessibilité plus élevée entre les éléments promoteurs et amplificateurs.

Pour évaluer les changements globaux dans l'accessibilité de la chromatine, les fragments ont été comptés et notés en fonction de leur proximité avec des emplacements génomiques tels que le site de début de transcription (TSS), les promoteurs, les amplificateurs et les sites d'hypersensibilité à la DNase I. Le traitement au TGFβ1 a augmenté l'accessibilité globale au niveau du TSS, des promoteurs et des sites d'hypersensibilité à la DNase I (Fig. 5b et données supplémentaires 5). Des changements significatifs ont été observés au niveau des activateurs en réponse au TGFβ1 et le prétraitement avec GSK343 ​​avant le TGFβ1 a généralement empêché ces changements d'accessibilité (Fig. 5b). Pour évaluer les changements d'accessibilité de la chromatine entre le groupe de myofibroblastes, MFib1, et son groupe parent, Fib2, nous avons noté le nombre de fragments présents au niveau du TSS, des promoteurs, des activateurs et des sites d'hypersensibilité à la DNase I (Fig. 5c, Données supplémentaires 6). En réponse au TGFβ1, l'accessibilité a été significativement augmentée dans les deux groupes de cellules au niveau des régions d'hypersensibilité des promoteurs, du TSS et de la DNase I. À l'inverse, une diminution de l'accessibilité a été notée au niveau des activateurs au sein de MFib1. Encore une fois, le prétraitement avec GSK343 ​​avant TGFβ1 a empêché de manière significative ces changements d'accessibilité (Fig. 5c).

Nous avons ensuite étudié les différences d'accessibilité à la chromatine entre MFib1 et Fib2 à l'aide de Signac. 10 678 régions différentiellement accessibles (DA) ont été identifiées dans MFib1 tandis que 10 222 régions ont été identifiées dans Fib2 (données supplémentaires 7). L'accessibilité de la chromatine au niveau des éléments régulateurs cis tels que les amplificateurs et les promoteurs signifie une densité de nucléosome réduite indiquant la liaison de facteurs de transcription spécifiques à la séquence. Les éléments de régulation ont tendance à se regrouper pour former des réseaux de co-accessibilité qui régulent l'expression des gènes31. Pour mieux comprendre le mécanisme par lequel TGFβ1 contrôle l'expression des gènes au niveau des éléments distaux, nous avons utilisé Cicero pour prédire les interactions cis de l'ADN régulateur dans les organoïdes témoins, TGFβ1 et TGFβ1 + GSK343 ​​pour les gènes exprimés de manière différentielle identifiés dans MFib1. Les gènes différentiellement régulés positivement dans MFib1 par rapport à Fib2 comprenaient l'αSMA (ACTA2) et la follistatine (FST). Pour ces deux gènes, le traitement par TGFβ1 a modifié la co-accessibilité entre les sites activateurs et promoteurs, tandis qu'un prétraitement avec GSK343 ​​a inversé cette augmentation d'une manière similaire à celle observée chez le témoin (Fig. 5d). Ces résultats indiquent que EZH2 peut être nécessaire pour les changements médiés par TGFβ1 dans la co-accessibilité de la chromatine et les interactions activateur-promoteur.

Les réseaux de co-accessibilité cis sont des familles de régions de chromatine qui peuvent être utilisées pour prédire les interactions en boucle entre des éléments régulateurs susceptibles d'être situés à proximité les uns des autres31. Nous avons ensuite cherché à savoir si le TGFβ1 augmentait les liens de co-accessibilité entre les éléments régulateurs aux emplacements d'amplificateurs putatifs identifiés comme étant occupés à la fois par SMAD3 et EZH2 dans nos expériences iPSC et NPC ChIP-seq. Dans les IPSC et les NPC, le TGFβ1 a augmenté les interactions régulatrices entre les éléments distaux en amont et en aval des régions amplificatrices putatives. Les connexions entre ces régions co-accessibles présumées n'ont pas été observées dans le contrôle ou dans les organoïdes prétraités avec GSK343 ​​(Fig. 11 supplémentaire).

Les amplificateurs et les promoteurs peuvent s'associer via des interactions à longue portée et cela est partiellement régulé par des facteurs de transcription32. Nous avons utilisé chromVAR pour prédire «l'activité» du facteur de transcription en fonction de la présence de motifs de liaison pour les régions différentiellement accessibles identifiées dans Fib2 et MFib1. Nous avons observé une activité de motif accrue pour SMAD3 et des membres de la famille AP1 tels que JUNB et FOSL2 (Fig. 6a, b), qui étaient exclusifs aux régions différentiellement accessibles identifiées dans MFib1 en réponse au TGFβ1. Le traitement avec GSK343 ​​a atténué cette activité (Fig. 6b). Une profondeur d'empreinte accrue a également été observée pour SMAD3, FOSL2 et JUNB (Fig. 6a, c, d). Nous avons ensuite utilisé SCENIC (Single-Cell rEgulatory Network Inference and Clustering), qui définit les principaux facteurs de transcription avec leurs gènes cibles régulés positivement dans des cellules individuelles, pour étudier ce réseau de régulation dans les données scRNAseq. Des études antérieures ont identifié AP1 comme un modulateur central de l'activité du TGFβ33,34,35. De même, nous avons identifié une activité élevée du régulon AP1 dans MFib1 en réponse au TGFβ1 (Fig. 6e, f et données supplémentaires 8), parmi plusieurs nouveaux régulons, notamment des membres de la famille ETS et d'autres facteurs de transcription associés à la fibrose (Fig. 6e et données supplémentaires 8). Cela établit que la réponse TGFβ1 nécessite le régulon AP1 pour la transition fibroblaste-myofibroblaste dans les organoïdes rénaux et identifie un mécanisme de régulation transcriptionnel centré sur la famille ETS et plusieurs facteurs de transcription associés à la fibrose, notamment NUAK1, CREB3L1 et RARG constituant une nouvelle hiérarchie de régulation.

une empreinte centrée sur le motif montrant l'enrichissement pour SMAD3. b Activité du motif au niveau des régions accessibles dans MFib1 traité avec TGFβ1 ou TGFβ1 + GSK343, par rapport à Fib2 (contrôle). L'enrichissement du motif AP1 dans les myofibroblastes est diminué par l'inhibition de EZH2. c, d Empreinte centrée sur le motif montrant un enrichissement pour les facteurs associés à un régulon "fibrotique" ; Sont illustrés des SCENIC-UMAP représentatifs des régulons des motifs enrichis supérieurs (panneaux de droite) et la correspondance avec les motifs enrichis scATACseq (panneaux centraux). e Réseaux de facteurs de transcription régulés de manière différentielle ("régulons") associés au complexe AP1, à la famille ETS et à d'autres facteurs de transcription associés à la fibrose dans MFib1 par rapport à son groupe parent Fib 2. f UMAP mixtes de régulon de facteurs de transcription pour FOSL2 et JUNB identifiés par SCENIC dans MFib1 et S1.

Les processus biochimiques qui contribuent à l'initiation et à la progression de la fibrose rénale sont de nature multifactorielle et consistent en l'interaction complexe entre de nombreuses voies de signalisation métaboliques et de facteur de croissance. À l'heure actuelle, des efforts intenses ont été consacrés aux médiateurs pathogènes cibles de la fibrose rénale tels que le stress oxydatif, l'inflammation, les AGE et les facteurs de croissance tels que TGFβ1, PDGF et CTGF (examinés dans la réf. 36). Certaines de ces stratégies ont réussi à retarder la progression dans les essais cliniques humains, mais la plupart n'ont pas restauré la fonction rénale.

Cette étude visait à modéliser les lésions rénales induites par le TGFβ1 à l'aide d'organoïdes rénaux dérivés d'iPSC. Une limitation majeure de ce modèle est l'immaturité organoïde, par exemple, la population de cellules de type podocyte dans l'organoïde sont au mieux des précurseurs immatures ; bien qu'ils aient été colorés positifs pour WT1, la coloration positive pour les marqueurs de diaphragme à fente comme la néphrine et la podocine était quelque peu équivoque. Tout en reconnaissant que les organoïdes représentent néanmoins des tissus immatures de type embryonnaire, les principaux résultats de cette étude ont ensuite été validés par de multiples modalités. Au sein de l'organoïde, trois nouveaux clusters ont été identifiés en réponse au TGFβ1 correspondant à deux populations stromales différenciées et à une population progénitrice épithéliale différenciée. Dans la fibrose, les modifications épigénétiques induites par le TGFβ1 telles que la méthylation de l'ADN et les modifications post-traductionnelles des histones sont nécessaires pour établir et maintenir l'activation persistante des fibroblastes. De plus, de plus en plus de preuves suggèrent qu'une expression anormale de EZH2 est associée à une fibrose accrue et contribue à la pathogenèse de la maladie rénale27,39. SMAD3 est essentiel pour réguler le destin cellulaire pendant le maintien de la pluripotence ainsi que pendant la différenciation dans le développement et la maladie14,40. Il est maintenant bien établi que SMAD3 coopère avec EZH2 pour médier les décisions du destin cellulaire dans les cellules épithéliales rétiniennes, les progéniteurs neuronaux, les cellules souches embryonnaires et les fibroblastes activés10,12,39,41. Nous avons démontré que SMAD3 et EZH2 co-localisent au niveau des amplificateurs putatifs et des régions d'hétérochromatine dans les iPSC et dans les cellules progénitrices du néphron dérivées de l'iPSC. SMAD3 est important pour le maintien de l'auto-renouvellement grâce à la coopération avec les principaux facteurs de pluripotence et les co-répresseurs42,43. Dans les CSE de souris, Smad3 et Oct4 interagissent avec PRC2 pour maintenir la répression de Rif1 afin de favoriser la stabilité génomique44. Dans nos données ChIP-seq, les régions co-occupées par SMAD3 et EZH2 dans les iPSC ont été largement enrichies pour les co-répresseurs tels que TEAD et BACH2. Nous proposons que SMAD3 est un régulateur principal du destin cellulaire et coopère avec EZH2 pour faciliter et maintenir dynamiquement les états de la chromatine afin de préserver la pluripotence dans les CSPi humaines. On pense également que SMAD3 participe au maintien de l'auto-renouvellement des PNJ dérivés d'iPSC45 et dans nos données ChIP-seq, SMAD3 et EZH2 co-occupent des sites initialement présumés répressifs mais sont susceptibles d'être dans un état plus dynamique. Nous postulons que SMAD3 et EZH2 régulent l'accessibilité de l'hétérochromatine à d'autres gènes spécifiques à la lignée de manière hautement conservée.

Nous avons montré que le prétraitement des organoïdes rénaux avec l'inhibiteur sélectif d'EZH2, GSK343, avant le TGFβ1 entraîne l'atténuation de l'expression du gène fibrotique, ce qui est corrélé à l'inhibition des changements induits par le TGFβ1 dans l'accessibilité de la chromatine. Bien que GSK343 ​​n'ait pas modifié de manière significative l'identité des clusters, plusieurs gènes cibles SMAD étaient clairement régulés à la baisse, reflétant probablement la nature pléiotrope (dépendante de SMAD et non dépendante de SMAD) de la signalisation TGFβ1. Dans de nombreux contextes, l'inhibition de EZH2 entraîne l'inactivation transcriptionnelle de la voie de signalisation TGFβ110,39,46. De plus, l'inhibition des HDAC, qui permettent la répression de l'expression génique, entraîne également un affaiblissement de la réponse transcriptionnelle du TGFβ138,47,48,49. Des études antérieures dans notre laboratoire ont montré que le double knockdown de SMAD3 et EZH2 dans les cellules épithéliales subissant une trans-différenciation en réponse au TGFβ entraîne la perte complète de l'expression du gène fibrotique et la rétention du marqueur de jonction épithéliale, CDH110. Cela suggérerait que SMAD3 semble nécessiter la reconnaissance de la chromatine compactée pour se lier et faciliter le remodelage de la chromatine avant d'établir sa réponse transcriptionnelle. Cette observation est conforme à celles d'autres chercheurs qui ont montré que les protéines SMAD peuvent se lier à la chromatine inactive et recruter des remodeleurs de la chromatine en l'absence d'un facteur de transcription pionnier50.

Notre étude reste quelque peu concluante concernant la façon dont SMAD3 et EZH2 interagissent au niveau de la chromatine, cependant, nous pouvons supposer que l'activité EZH2 est nécessaire pour que cette interaction ait lieu, suggérant à son tour que la co-occupation génomique est une condition préalable ; bien que cela puisse encore impliquer des protéines "de liaison" supplémentaires dans le cadre d'un complexe plus large. En l'absence d'EZH2, il est possible que le SMAD3 phosphorylé persiste sous une forme non complexée. Nous suggérons que SMAD3 augmente l'accessibilité de la chromatine de l'une des trois manières. GSK343 ​​se lie à l'intérieur du domaine SET chevauchant le site de liaison SAM30,51, inhibant ainsi les interactions au sein de la poche de liaison. Par conséquent, une première possibilité est que SMAD3 reconnaisse et interagisse avec EZH2, peut-être au niveau du domaine catalytique SET, ou alternativement à un autre site sur la molécule EZH2. Une deuxième possibilité est que SMAD3 interagisse indirectement avec EZH2 via des miARN ou un mécanisme apparenté. Un troisième mécanisme potentiel par lequel SMAD3 peut reconnaître la marque H3K27me3 est l'interaction avec les lecteurs d'histones (Fig. 12 supplémentaire). Un candidat est la sous-unité EED de PRC2, qui a la capacité de liaison H3K27me3 via son domaine WD40. Cette liaison améliore l'activité de PRC2 grâce à une boucle de rétroaction positive qui permet au compactage médié par PRC2 de se propager aux nucléosomes adjacents52. D'autres candidats incluent les protéines de type Polycomb PHF1 et PHF19, que nous avons détectées dans les expériences de purification par affinité EZH2 ;10,12 Les deux protéines peuvent améliorer l'activité catalytique de PRC253,54. Cependant, il a été démontré que SMAD3 se lie et forme des complexes avec de nombreux lecteurs d'histones, y compris ceux contenant des homéodomaines végétaux, des chromo- ou bromodomaines qui se lient et reconnaissent les modifications d'histones pour promouvoir l'activité transcriptionnelle médiée par SMAD, de sorte que la gamme de candidats avec lesquels SMAD3 peut interagir est large55,56.

À notre connaissance, c'est la première fois que les ensembles de données scRNAseq et scATACseq sont intégrés pour examiner les changements induits par le TGFβ1 dans l'accessibilité de la chromatine au sein des populations de fibroblastes en cours de différenciation en myofibroblastes. La régulation transcriptionnelle par les complexes SMAD nécessite le remodelage de la chromatine et cela peut être facilité par la coopération de SMAD3 avec d'autres complexes de facteurs de transcription. Par exemple, les motifs de liaison SMAD3 et AP1 étaient fortement enrichis dans le cluster de myofibroblastes activés. De plus, nous avons identifié une activité élevée du régulon AP1 dans MFib1 en réponse au TGFβ1, ainsi qu'une activité accrue du régulon pour les membres de la famille ETS et d'autres facteurs de transcription associés à la fibrose (CREB3L1, NUAK1, RARG); qui sont tous augmentés dans le rein fibrotique57,58,59. Dans les cellules épithéliales mammaires subissant une trans-différenciation, on pense que SMAD3 interagit avec AP1 pour faciliter une accessibilité accrue de la chromatine35 au niveau des régions activatrices60. AP1 est important pour la sélection et l'accessibilité accrue des activateurs dans différents types de cellules grâce au recrutement de SWI/SNF61. De plus, des études antérieures ont établi que SMARCA4 est nécessaire à la transcription de nombreux gènes cibles du TGFβ50,62. Nous supposons que SMAD3 peut recruter et/ou coopérer avec AP1 pour identifier des loci spécifiques afin de faciliter l'ouverture de l'activateur ; cette coopération conduit au recrutement de complexes de remodelage de la chromatine tels que SWI/SNF, qui déplacent les nucléosomes pour faciliter l'accessibilité de la chromatine et l'antagonisme du complexe répressif polycomb. Le déplacement du complexe PRC2/EZH2 et la suppression de la marque H3K27me3 nécessitent le recrutement du domaine JmjC contenant les histones déméthylases UTX et JMJD3 qui déméthylent H3K27 triméthylé permettant une accessibilité accrue à la chromatine63. SMAD3 est connu pour recruter et interagir physiquement avec JMJD3/UTX pendant la différenciation64 et la reprogrammation cellulaire65 et avec le remodeleur de la chromatine dépendant de l'ATP, CHD8, ils établissent un paysage de chromatine accessible et l'activation des gènes nécessaires à la spécification du destin cellulaire66,67. Il est possible que SMAD3 recrute simultanément des histones déméthylases comme JMJD3 pour faciliter une accessibilité accrue. Cela fournit l'image la plus claire à ce jour d'une empreinte fibrotique induite par le TGFβ1, essentielle à l'activation des myofibroblastes.

La formation de gradients de concentration (condensats) de la machinerie transcriptionnelle dans les régions régulatrices peut déterminer quels gènes doivent être activés ou désactivés68,69,70,71. Peu de facteurs de transcription pionniers orchestrent la formation de condensat et peuvent interagir simultanément avec de nombreux co-activateurs différents de manière désordonnée via leur domaine d'activation68. Il a été démontré que l'hétérochromatine forme des condensats dynamiques de type liquide compatibles avec ceux des condensats d'activation72. Bien que l'activation et les condensats d'hétérochromatine ne se chevauchent pas72, nous supposons que des changements dans les gradients de concentration des facteurs de transcription et des cofacteurs peuvent permettre un basculement dynamique entre les deux phases. Ce modèle de régulation génique peut indiquer un mécanisme par lequel SMAD3, par le biais d'interactions rapides avec la chromatine, peut induire dynamiquement le remodelage de la chromatine et interagir simultanément avec divers cofacteurs (par exemple, HAT, co-activateurs, co-répresseurs, PRC2 et/ ou HDAC) pour activer et réprimer la transcription.

En résumé, les travaux présentés dans ce manuscrit ont généré une meilleure compréhension des mécanismes épigénétiques par lesquels la voie de signalisation TGFβ régit le destin cellulaire au cours de la différenciation dans le développement et la maladie rénale. Nous proposons que la fonction enzymatique du complexe répressif polycomb est nécessaire pour l'augmentation induite par le TGFβ1 de l'accessibilité de la chromatine et ses fonctions de régulation génique ultérieures. Avant de pouvoir exploiter ce mécanisme à des fins thérapeutiques, une évaluation plus approfondie est nécessaire pour déterminer comment la coopération entre le TGFβ et la chromatine facilite la régulation des gènes nécessaires à la spécification du destin dans des contextes physiologiques et pathologiques.

Toutes les expériences ont été réalisées dans la lignée iPSC humaine HPSI1213i-babk_2 achetée auprès de l'ECACC. Les CSPi ont été maintenus sur des plaques revêtues de Vitronectin XF (StemCell Technologies, n° de catalogue 07180) dans Essential E8 Flex (ThermoFisher Scientific, n° de catalogue A2858501) à 37 °C/5 % de CO2. Le repiquage cellulaire a été réalisé à l'aide de ReLeSR™ (StemCell Technologies, cat. n° 05872) selon les méthodes décrites par le fabricant.

Les CSPi aux passages 32 à 38 ont été différenciées à l'aide d'un protocole adapté de13. En bref, 15 100 cellules par cm2 ont été ensemencées avant différenciation. Le jour de la différenciation (jour 0), le milieu a été remplacé par du milieu STEMdiff APEL2 (StemCell Technologies, n° cat. 05275) additionné de 8 µM de CHIR99021 (Sigma-Aldrich, n° cat. SML1046), 5 % (v/v ) Milieu d'hybridome sans protéine PFHM-II (ThermoFisher Scientific, n° de catalogue 12040077) et 1 % (v/v) antibiotique-antimycotique (100X) (AA) (ThermoFisher Scientific, n° de catalogue 15240062). Au jour 3, le milieu a été remplacé par APEL2 additionné de 200 ng ml-1 de FGF9 humain (StemCell Technologies, n° cat. 78161.1), 1 µg ml-1 d'héparine (Sigma-Aldrich, n° cat. H4784), 5 % ( v/v) PFHM-II et 1 % (v/v) AA. Le milieu était changé toutes les 48 h. Au jour 7, les cellules progénitrices ont été cultivées dans 5 µM de CHIR99021 pendant 1 h avant la granulation à 300 × g pendant 3 minutes. Les culots ont été transférés sur des filtres transpuits PET à pores de 0, 4 µm et cultivés jusqu'au jour 12 dans APEL2 additionné de FGF9 et d'héparine. Au jour 12, les facteurs de croissance ont été éliminés et les organoïdes ont mûri jusqu'au jour 24. Le milieu a été reconstitué toutes les 48 h au cours de la différenciation. Au jour 24, les organoïdes ont été traités avec 10 ng/ml de TGFβ1 recombinant humain (Promokine) pendant 48 h avec une exposition répétée après 24 h. 0,1 % (p/v) de BSA a servi de véhicule témoin. Les organoïdes du même lot ont été prétraités avec ou sans GSK343 ​​5 µM (Sigma Aldrich, n° de catalogue SML0766) pendant 1 h avant les traitements au TGFβ1. Le DMSO a servi de véhicule témoin.

Les organoïdes (jour 7 ou jour 26) ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 2 % (v/v) et cryoprotégés dans un gradient de saccharose de 10 à 30 % (p/v). Les organoïdes ont été congelés instantanément dans de la gélatine / saccharose à 7, 5/10% (p / v) à -70 ° C à l'aide d'un bain d'isopropanol. Les organoïdes ont été cryosectionnés en sections de 10 à 20 µm à l'aide d'un cryostat Leica CM3050S réglé à -20 °C. Les coupes ont été réchauffées à température ambiante et la récupération de l'antigène a été effectuée en utilisant du SDS à 1 % (p/v) dans du DPBS pendant 10 minutes. Les sections ont été bloquées pendant 1 h à température ambiante en utilisant une solution de blocage (5 % (v/v) de sérum de chèvre, 0,1 % (v/v) de triton X-100, DPBS). Les sections ont été incubées dans l'anticorps primaire à 4 ° C pendant la nuit. Pour le LTL, les coupes ont été bloquées à l'aide d'un kit de blocage streptavidine-biotine avant incubation avec le LTL (5 µg ml-1 ; Vector Labs, cat no. B-1325-2). Après incubation, les coupes ont été lavées avec du DPBS et incubées pendant une nuit à 4 °C avec Hoechst33342 (1:1000) et l'anticorps secondaire conjugué à la fluorescence correspondant (ThermoFisher, cat. n° A-11001 et A-11011) dilué dans 5 % (v/v) sérum de chèvre (Sigma Aldrich, cat no. G9023). Pour LTL, les coupes ont été lavées avec du DPBS, incubées avec de la streptavidine Dylight 649 (Vector Labs, cat. n° SA-5649-1) pendant 20 min à température ambiante et Hoeschst33342 (1:500) (ThermoFisher Scientific, cat. n° H3570 ) pendant 10 min à TA. L'imagerie a été réalisée sur un microscope confocal Leica SP8 ou Zeiss LSM800 en utilisant un objectif à air 20X ou à huile 40X. Pour la coloration de l'actine du muscle lisse alpha et de la périostine, les temps d'exposition et la puissance du laser sont restés constants entre toutes les conditions. Les anticorps et les dilutions étaient : CDH1 (1:300 ; 610181, BD Bioscience), Laminin (1:300 ; L9393, Sigma), ZO-1 (1:300 ; 61-7300, Invitrogen), MEIS1/2/3 (1 :100 ; sc-101850, Santa Cruz), WT1 (1:200 ; sc-393498, Santa Cruz), SIX2 (1:300, 11562-1-AP, Invitrogen), périostine (POSTN) (1:300 ; PA534641 , Invitrogen), PDGFRA (1:300 ; PA516571, Invitrogen), PDGFRB (1:300 ; 3169, signalisation cellulaire) et actine alpha du muscle lisse (αSMA) (1:300 ; A5228, Sigma). Les réglages de luminosité et de contraste ont été effectués à l'aide de Fiji/ImageJ.

Les iPSC aux passages 32 à 38 ont été différenciés pendant 7 jours sur des lames µ Ibidi à 8 puits en utilisant un protocole adapté de13. Les cellules différenciées pendant 0, 3 et 7 jours ont été fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % (v/v) pendant 10 min à température ambiante et bloquées pendant 1 h à température ambiante en utilisant une solution de blocage contenant 5 % (v/v) de sérum de chèvre ou d'âne. Les cellules ont été incubées dans un anticorps primaire à 4°C pendant une nuit. Après incubation, les cellules ont été lavées avec du DPBS et incubées pendant une nuit à 4 ° C avec Hoechst33342 et leur anticorps secondaire conjugué à la fluorescence correspondant (1: 200-500). Les images ont été acquises à l'aide d'un microscope confocal Leica SP8. Les anticorps et dilutions utilisés étaient OCT4 (1:300; sc-5279, Santa Cruz), Brachyury (1:100; AF2085, R&D), HOXD11 (1:200; SAB1403944, Sigma), PAX2 (1:200; 71-6000 , Invitrogen).

Les organoïdes au jour 26 ont été cultivés avec 10 µg ml-1 de 10 000 MW dextran Alexa647 conjugué (ThermoFisher, cat. No. D22914) pendant 24 h. Les organoïdes ont été fixés et colorés sans perméabilisation. Les images ont été acquises à l'aide d'un microscope confocal Leica SP8.

Les coupes ont été colorées avec de l'hématoxyline de Mayer pendant 6 min, puis lavées à l'eau courante chaude du robinet pendant 5 min. Les coupes ont été colorées avec 0,5 % (v/v) d'éosine Y pendant 6 min et lavées pendant 3 min dans de l'eau distillée courante. Les coupes ont été déshydratées avec de l'éthanol à 95 % et 100 %. Les sections ont été incubées dans du xylène avant d'être montées à l'aide de DPX Mountant. Pour la coloration au rouge picrosirius, les coupes ont été réhydratées dans du DPBS pendant 10 min, puis post-fixées dans du PFA à 4 % (v/v) pendant 30 min à température ambiante. Les coupes ont été colorées à l'aide du kit de coloration au rouge picrosirius (Polysciences, cat. n° 24901) selon les instructions du fabricant. Les coupes ont été déshydratées avec de l'éthanol à 100 % et incubées dans du xylène avant d'être montées à l'aide d'un milieu de montage DPX. Les sections ont été imagées à l'aide d'un objectif 10X et d'un appareil photo Canon EOS600D installé sur un microscope à lumière de transmission Nikon 80i.

Les résultats sont représentatifs des observations et analyses similaires effectuées dans plusieurs expériences indépendantes et répétitions techniques. Des expériences indépendantes ont été classées comme des différenciations monocouches ou des organoïdes dérivés de passages séparés et/ou de freezebacks. Le nombre de répétitions pour chaque expérience est indiqué dans les légendes des figures correspondantes. Les organoïdes utilisés dans les expériences de séquençage d'ARN et d'ATAC unicellulaires ont été différenciés à partir d'un seul puits de hiPSC et trois organoïdes ont été regroupés dans le cadre d'une seule expérience indépendante et dissociés pour scRNAseq et scATACseq. Les expériences ChIPseq incluaient des cellules de deux expériences indépendantes. La caractérisation des organoïdes a été réalisée sur 3 à 4 organoïdes à partir d'un minimum de 3 expériences indépendantes. L'analyse immunofluorescente a été réalisée sur un organoïde par condition, à partir de trois expériences indépendantes (Figs. 3d-f et 4d-f). L'analyse histologique a été réalisée sur un organoïde par condition, à partir de quatre expériences indépendantes (Fig. 8 supplémentaire). Dans la mesure du possible, des outils et des méthodes statistiques couramment disponibles ont été utilisés. Fidji/ImageJ (version : 2.1.0/1.53q)73 a été utilisé pour la quantification des zones αSMA/DAPI et POSTN/DAPI, et la quantification de la coloration rouge picrosirius. L'analyse statistique a été effectuée dans GraphPad Prism (version : 8.3.0) et les valeurs P ont été estimées par un test t non apparié.

Les organoïdes ont été fixés dans du PFA à 2 % (v/v) et du glutaraldéhyde à 2,5 % (v/v) dans un tampon phosphate Sorensens 0,1 M (Na2HPO4 0,133 M, KH2PO4 0,133 M) pendant une nuit à 4 °C. Les organoïdes ont été incubés dans du tétroxyde d'osmium à 1 % (v/v) pendant 1 h à température ambiante, suivis d'une incubation dans de l'acide tannique à 1 % (v/v) pendant 1 h à température ambiante. Les organoïdes ont été déshydratés dans de l'éthanol à 70, 90 et 100 %. Les organoïdes ont été incubés dans un mélange 50:50 d'éthanol à 100 % : résine époxy Agar 100 EPON (48,6 % résine époxy Agar 100, 18,2 % anhydride dodénylsuccinique DDSA, 30,4 % anhydride méthylnadique, 2,8 % BDMA benzyldiméthylamine) pendant la nuit sur un rotateur à RT. Les organoïdes ont ensuite été incubés dans 100% Agar 100 EPON pendant 4 heures à 37 ° C pour évaporer tout éthanol restant. Après incubation, les organoïdes ont été polymérisés dans de l'EPON frais à 60 ° C pendant la nuit. Les ultrasections ont été imagées à l'aide d'un microscope électronique à transmission FEI Tecnai T12 à une tension d'accélération de 120 Kv. Les images ont été analysées à l'aide d'ImageJ/Fiji. Des coupes semi-fines ont été colorées avec du bleu de toluidine à 60 ° C pendant 1 min et lavées avec de l'eau ddH2O. Les lamelles ont été montées à l'aide de DPX et les sections ont été imagées à l'aide d'un microscope à lumière de transmission Nikon E80i.

Les CSPi ont été différenciées pendant 7 jours selon un protocole adapté de13. Des extraits de protéines de cellules entières ont été isolés et un transfert Western a été effectué en utilisant des protocoles de transfert Western standard utilisant des gels de polyacrylamide à 8-12 %. Les anticorps primaires utilisés étaient H3K27me3 (1:500 ; 39155, Motif actif), H3K4me3 (1:1000 ; ab12209, Abcam), EZH2 (1:5000 ; 5246, Signalisation cellulaire), SMAD3 (1:2000 ; ab28379, Abcam), SMAD3 phosphorylé (1:2000; ab52903, Abcam). La bêta-actine (1:20 000 ; A5316, Sigma) a servi de contrôle de charge. La détection a été effectuée à l'aide de l'ECL Advansta WesternBright (Advansta, n° de catalogue K12045) et du Vilber Fusion XF Imager.

Les iPSC et les progéniteurs différenciés utilisés pour les expériences ChIP-seq ont été obtenus à partir de deux expériences indépendantes. Les iPSC ont été cultivées dans des plaques de 100 mm et différenciées pendant 0 ou 7 jours en utilisant un protocole adapté de13. La chromatine de 5 × 107 cellules a été préparée pour le cisaillement à l'aide du kit de cisaillement Covaris truChIP (Covaris, n° de catalogue 520237) conformément au protocole du fabricant. La chromatine a été cisaillée dans un microtube AFA pré-refroidi à l'aide d'un ultrasonateur focalisé Covaris E220 Evolution AFA pendant 20 min à un facteur d'utilisation de 2%, 200 cycles par rafale et une puissance incidente maximale de 140. L'immunoprécipitation a été réalisée avec 3 µg Smad3 (Abcam , n° cat. ab28379) ou 2,5 µg d'anticorps EZH2 (Cell Signalling, n° cat. 5246) comme décrit précédemment14. En bref, des billes magnétiques de protéine G (ThermoFisher, n° de catalogue 10003D) ont été pré-bloquées dans 1 x PBS avec 0,5 % de BSA avant incubation avec des anticorps sur un rotateur pendant une nuit à 4 °C. La chromatine cisaillée a été diluée quatre fois dans un tampon de dilution (NaCl 140 mM, HEPES 50 mM pH 8,0, EDTA 1 mM, Triton X-100 0,75 %, désoxycholate de Na 0,1 %, cocktail inhibiteur de protéase 1X) et mélangée avec 30 µl de dynabead- mélange d'anticorps. Les échantillons ont été incubés pendant une nuit par rotation à 4°C. Les billes ont ensuite été lavées une fois avec un tampon à faible teneur en sel (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8,0, 0,1 % SDS), un tampon à forte teneur en sel (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8,0, 0,1 % SDS), tampon LiCl (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0, 250 nM LiCl, 1 % IGEPAL), et deux fois avec du tampon TE contenant 50 mM NaCl (10 mM Tris- HCl pH 8,0, EDTA 1 mM pH 8,0, NaCl 50 mM). Les échantillons ont été élués dans 100 µl de tampon d'élution (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 1 % SDS) à 65 °C pendant 45 min avec vortex toutes les 5 min. Les échantillons ont été centrifugés à 16 000 × g pendant 1 min à température ambiante. L'extrait de cellules entières (WCE) à utiliser pour l'entrée a été dilué trois fois avec un tampon d'élution. La réticulation a été inversée dans tous les échantillons par incubation à 65°C pendant une nuit. 100 ul de tampon TE ont été ajoutés à chaque échantillon pour diluer le SDS dans le tampon d'élution. L'ADN réticulé inverse a été traité avec la RNase A et la protéinase K pendant 2 h à 37 ° C et 55 ° C, respectivement. L'ADN ébréché a été purifié à l'aide du kit de purification QIAquick PCR (Qiagen, cat. n° 28104) et élué dans 70 µl de tampon d'élution. Les bibliothèques ChIP ont été préparées à l'aide du kit de préparation d'échantillons Illumina TruSeq ChIP (Illumina, n° de catalogue IP-202-1012). Le séquençage 1 × 75 à une extrémité a été réalisé sur une plate-forme Illumina NextSeq 550, à l'aide d'adaptateurs Illumina à double indice.

Les organoïdes utilisés dans les expériences de séquençage d'ARN unicellulaire ont été différenciés à partir d'un seul puits de passage 35 hiPSC. Au jour 24, trois organoïdes ont été regroupés dans le cadre d'une seule expérience indépendante et dissociés pour scRNAseq. Les organoïdes ont été dissociés en suspension unicellulaire en utilisant la méthode de la protéase active à froid adaptée de74. Les organoïdes ont été dissociés dans un tampon de dissociation (10 mg ml-1 Bacillus lichenformis (Sigma-Aldrich, cat. n° P5380), 125 U ml-1 DNase I (ThermoFisher, cat. n° 90083), 5 mM CaCl2 dans DPBS) par trituration douce pendant 15 min sur glace. Les cellules ont été collectées à l'aide de SmartStrainers MACS de 40 µm et 70 µm et centrifugées à 300 xg pendant 5 min. Les culots ont été remis en suspension dans du PBS 1X avec 2 % de BSA et filtrés à l'aide d'un tamis cellulaire Flowmi de 40 µm (Sigma Aldrich, n° de catalogue BAH136800040). Les concentrations et la viabilité des cellules ont été évaluées à l'aide d'une coloration au bleu trypan. 10 000 cellules individuelles ont été chargées sur la puce 10X Chromium à l'aide du kit de réactifs Single Cell 3 '(version : 3.1) conformément au protocole du fabricant. Après la préparation et la quantification des librairies, les librairies ont été séquencées sur la plateforme Illumina NextSeq 550.

Les organoïdes utilisés dans les expériences de séquençage ATAC à cellule unique ont été différenciés à partir d'un seul puits de passage 34 hiPSC. Au jour 24, trois organoïdes ont été regroupés dans le cadre d'une seule expérience indépendante et dissociés pour scATACseq comme décrit précédemment. Les cellules ont été lysées pendant 5 min dans 100 µl de tampon de lyse réfrigéré 0,1X (Tris-HCl 10 mM (pH 7,4), NaCl 10 mM, MgCl2 3 mM, 1 % BSA, 0,01 % Tween-20, 0,01 % IGEPAL CA-630, 0,001 % Digitonine). La concentration et la viabilité des noyaux ont été déterminées en utilisant l'homodimère d'éthidium-1 (2 mM). Les bibliothèques scATACseq ont été générées à l'aide de la bibliothèque 10X Genomics Chromium ATAC et du kit Gel Bead (version : 1.1) conformément au protocole du fabricant. Les bibliothèques ont été séquencées à l'aide d'une plate-forme Illumina NovaSeq 6000.

Illumina BaseSpace a été utilisé pour aligner les séquences sur le génome hg19. L'appel de pic a été effectué sur des répliques fusionnées à l'aide d'EaSeq (version : 1.111)75 en utilisant la méthode de seuillage local adaptatif et les paramètres par défaut. Les pics chevauchant les éléments de la liste noire tels que définis par le projet ENCODE76 ont été supprimés. Les visualisations de données ont été réalisées dans EaSeq. La segmentation de l'état de la chromatine a été réalisée pour les iPSC à l'aide de ChromHMM d'ENCODE sur le navigateur de génome UCSC (GRCH37/hg19)77,78. La segmentation de l'état de la chromatine a été réalisée pour les progéniteurs du néphron à l'aide du modèle de chromatine à 25 états de l'épigénome du rein fœtal humain (17 semaines de gestation) (EID : E086 ; Donor/Sample ID : H-22676) de79. Pour l'analyse des motifs, des séquences de pointe ont été générées à l'aide d'EaSeq. Les séquences ont été extraites des fichiers fasta de l'assemblage du génome 'hg19' chargé à partir de l'UCSC80,81. Homer (version : 4.11)82 a été utilisé pour effectuer une analyse complète des motifs en utilisant les paramètres par défaut83. Les activateurs potentiels ont été identifiés à l'aide des données sur les cellules souches embryonnaires humaines et les reins fœtaux sur Enhancer Atlas (version : 1.0)84 et GeneHancer (version : 4.8)85. Les pistes BigWig pour tous les échantillons ont été générées à l'aide de l'outil bamCoverage (taille Bin = 25 bp) sur le serveur public à usegalaxy.org86. Les pistes BigWig ont été visualisées à l'aide du UCSC Genome Browser87.

Cell Ranger (version : 3.1.0) a été utilisé pour démultiplexer, aligner et générer des comptages de caractéristiques de cellule unique. scDblFinder a été utilisé pour supprimer les doublets suspects. Seurat (version : 3.0)88 a été utilisé pour filtrer les cellules de faible qualité (contenant des gènes uniques ou des UMI > 2 écarts-types au-dessus de la médiane pour tous les échantillons ou contenant > 25 % de lectures mitochondriales). Après CQ, 15 583 cellules de haute qualité ont été obtenues (Contrôle : 4057 ; TGFβ1 : 4119, GSK343 : 3584 ; GSK343 ​​+ TGFβ1 : 3823). Les ensembles de données scRNAseq ont été normalisés à l'aide de la normalisation basée sur SCTransform88, en faisant régresser le % de lectures mitochondriales et la différence entre les scores de cycle cellulaire G2M et S tels que calculés par Seurat. Ensuite, une réduction dimensionnelle par analyse en composantes principales a été effectuée sur la base des 2000 principales caractéristiques variables telles que calculées par SCTransform. Soixante composantes principales ont été sélectionnées pour construire un graphe des K plus proches voisins. En utilisant une résolution de 0,5, les cellules ont été regroupées et classées en 17 types de cellules par sous-regroupement et combinaison des grappes détectées selon les besoins. Pour visualiser ces clusters, une approximation et une projection uniformes de la variété (UMAP) ont été générées à l'aide des mêmes composants principaux que ceux utilisés pour construire le graphe des K voisins les plus proches. L'attribution du type de cellule a été effectuée sur la base de gènes marqueurs positifs et négatifs identifiés dans d'autres ensembles de données organoïdes. L'ontologie des gènes a été réalisée à l'aide de Panther (version : 17.0)89,90.

Les scores de phase du cycle cellulaire ont été calculés à l'aide de Seurat. L'expression des gènes du matrisome central et du TGFβ précédemment décrits91,92 a été résumée sur la base de données d'expression génique normalisées en utilisant la même méthode que celle utilisée pour l'analyse du cycle cellulaire.

La diffusion de chaleur pour l'incorporation de transition basée sur l'affinité (PHATE) a été utilisée pour identifier les trajectoires cellulaires temporelles et cartographier les lignées du destin cellulaire pour chacun des clusters93. Les trajectoires ont été visualisées à l'aide du logiciel Cerebro (version : 1.2)94. Les trajectoires pseudo-temporelles ont été visualisées à l'aide du logiciel BBrowser (version : 2.10) (Bioturing, https://bioturing.com).

Le test d'expression différentielle entre les grappes stromales a été effectué à l'aide du test de somme des rangs de Wilcoxon. Les réseaux de gènes différentiellement exprimés ont été analysés et visualisés à l'aide de Cytoscape (version : 3.8.1)95.

Les réseaux d'interaction protéine-protéine ont été obtenus à l'aide de la base de données publique STRING en utilisant un score de confiance de 0,4 ou plus pour les interactions. L'enrichissement de l'ontologie fonctionnelle des gènes a été obtenu à l'aide de l'application d'enrichissement STRING (version 11.5)96.

Cell Ranger ATAC (version : 1.2.0) a été utilisé pour le démultiplexage et l'alignement. Les quatre conditions ont été regroupées. Les ensembles de données scATACseq ont été prétraités à l'aide de Signac (version : 1.1)97. Pour effectuer un contrôle de qualité, les cellules avec des fragments de région de pic <3000 ou> 20 000, % de lectures dans les pics <15, rapport de liste noire> 0,05, signal nucléosome> 4 et enrichissement du site de début de transcription (TSS) <2 ont été supprimés.

Pour visualiser les données, une approximation et une projection uniformes de la variété (UMAP) ont été générées à l'aide de la même méthode de réduction que celle utilisée pour construire le graphe K-plus proche voisin. Pour visualiser l'activité prédite des gènes marqueurs canoniques, une matrice d'activité génique a été générée et normalisée en utilisant le nombre de fragments à partir de coordonnées extraites situées jusqu'à 2 kb en amont des promoteurs de gènes et dans les corps de gènes. L'annotation de type cellulaire a été effectuée à l'aide de la fonction de transfert d'étiquettes de Seurat pour transférer les identités de type cellulaire des données scRNAseq aux données scATACseq. Tout d'abord, des ancres ont été identifiées à partir de la matrice d'activité génique pour transférer les étiquettes de cluster de type cellulaire entre les ensembles de données. Des modèles corrélés entre l'activité des gènes et le RNAseq ont été notés et utilisés pour prédire l'annotation. Les étiquettes transférées ont été combinées avec le regroupement basé sur la matrice SVD-TDIF précédemment calculée, l'intégration de l'ensemble de données à l'aide d'Harmony98 et l'activité génique prédite des gènes marqueurs de cluster identifiés à partir du RNAseq pour former les attributions finales de type cellulaire. Au total, les étiquettes de 13 types de cellules ont été transférées des données scRNAseq aux données scATACseq. Les 4 types de cellules restants identifiés dans les données scRNAseq étaient principalement constitués de populations proliférantes de types cellulaires déjà présents et n'ont pas pu être identifiés comme des grappes distinctes dans le scATACseq.

Pour obtenir une vue globale et des changements d'accessibilité basés sur les clusters dans les régions régulatrices, le nombre de fragments situés dans les classes de régions régulatrices (sites de début de transcription, amplificateurs, promoteurs et régions hypersensibles à l'ADNase) tels qu'annotés par Cell Ranger ATAC dans chaque cellule ont été extrait et divisé par le nombre total de fragments dans chaque cellule qui ont passé le filtrage par Cell Ranger ATAC. Ces scores ont ensuite été notés en tant que métadonnées dans l'objet Seurat et visualisés à l'aide du package ggplot2. Pour les tests statistiques, les packages ggpubr et rstatix ​​ont été utilisés pour comparer les moyennes entre les groupes de traitement par un test t non apparié avec correction de Bonferroni post-hoc pour les tests multiples.

Le package Cicero de Signac a été utilisé pour construire et prédire les connexions de co-accessibilité cis31. Des tests d'accessibilité différentiels entre les grappes stromales ont été effectués à l'aide d'un test de régression logistique utilisant le nombre total de fragments comme variable latente avec un min.pct de 0,25. L'ontologie des gènes a été réalisée à l'aide d'Enrichr99.

L'analyse des motifs de séquence d'ADN a été réalisée à Signac. Pour trouver des motifs surreprésentés pour les pics différentiellement accessibles identifiés dans Fib2 et MFib1, des matrices de fréquence de position de motif ont été extraites de la base de données JASPAR2020100. Pour trouver des séquences régulatrices spécifiques de type cellulaire, un test hypergéométrique a été réalisé pour examiner la possibilité d'observer le motif aux loci donnés. Les activités de motif par cellule ont été calculées à l'aide de chromVAR dans Signac101. Pour effectuer une analyse d'empreinte du facteur de transcription, la fréquence d'insertion Tn5 attendue a été calculée pour chaque instance du motif d'entrée dans Signac.

SCENIC102 a été utilisé pour déterminer les facteurs de transcription réglementaires potentiels via le pipeline VSN nextflow (v0.26.1)103 en utilisant les paramètres par défaut conformément à la vignette du développeur (https://github.com/aertslab/SCENIC). Comme SCENIC est un algorithme stochastique et que les résultats peuvent différer à chaque exécution en fonction de la graine aléatoire générée, le pipeline scénique complet a été itéré 100 fois, ne conservant que les régulons présents dans plus de 80 % des exécutions. SCOPE104 a été utilisé pour l'exploration initiale des résultats. Une analyse plus approfondie a été effectuée dans R.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les ensembles de données à l'appui des conclusions de cette étude ont été déposés chez ArrayExpress avec les codes d'accès : données ChIP-seq (numéro d'accès : E-MTAB-10910), données RNAseq à cellule unique (numéro d'accès : E-MTAB-11138) et données ATAC-seq à cellule unique (numéro d'accès : E-MTAB-11139). Les données sources pour les graphiques ChIPseq (Fig. 1a, b supplémentaires) et l'analyse statistique des images d'immunofluorescence et histologiques (Figs. 3e, f, 4e, f et Fig. 8b supplémentaires) sont disponibles dans les données supplémentaires 9. Données sources pour les transferts Western sont disponibles dans la Fig. 13 supplémentaire.

Tout le code R utilisé dans cet article a été déposé sur GitHub et est disponible sur : https://github.com/CiaranKennedyUCD/Kidney_Organoid_Paper_scRNA_ATAC_seq (doi : 10.5281/zenodo.7311441).

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Les auteurs remercient Tiina O'Neill du Conway Institute Imaging Core pour son expertise en TEM. La microscopie confocale a été réalisée au Nano Research Facility de la Dublin City University et au UCD Conway Institute Imaging Core. Les travaux dans le laboratoire de JC ont été soutenus par des subventions de la Science Foundation Ireland (16/IA/4584, 19/FFP/6833) et sont cofinancés par le Fonds européen de développement régional (13/RC/2073_2) et la bourse d'études supérieures du Conseil irlandais de la recherche. (GOIPG/2016/91). Nous remercions également le Sanford Burnham Prebys Institute (SBP) Bioinformatics and Next Generation Sequencing Cores, qui sont soutenus par la subvention P30 CA030199 du NCI Cancer Center Support de SBP.

UCD School of Biomolecular and Biomedical Science, UCD Conway Institute of Biomolecular and Biomedical Research, University College Dublin, Belfield, Dublin, 4, Irlande

Jessica L. Davis, Ciaran Kennedy, Shane Clerkin, Niall J. Treacy, Thomas Dodd, Gerard Cagney et John Crean

UCD Genomics Core Facility, UCD Conway Institute of Biomolecular and Biomedical Research, University College Dublin, Belfield, Dublin, 4, Irlande

Catherine Moss et Alison Murphy

Wellcome-Wolfson Institute for Experimental Medicine, Queen's University Belfast, BT9 7BL, Irlande du Nord, Royaume-Uni

Derek P. Brésil

UCD School of Chemistry, University College Dublin, Belfield, Dublin, 4, Irlande

Dermot F. Brougham

Sanford Burnham Prebys Institute for Medical Discovery, La Jolla, Californie, 92037, États-Unis

Rabi Murad, Darren Finlay et Kristiina Vuori

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Conceptualisation, JC et JLD ; Méthodologie, JLD, SC, NJT et TD ; Analyse unicellulaire, CK et JLD ; Enquête, JLD, SC, NT, TD, CM et AM ; Ressources, CM, AM, RM, DF et KV ; Rédaction – brouillon original, JLD et JC ; Rédaction – révision et édition, JLD, JC, NJT, SC, DPB, GC, DFB, DF, KV ; Supervision, JC ; Acquisition de financement, JC, GC, DPB, KV, DFB et JLD

Correspondance avec John Crean.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Ryuji Morizane et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la manipulation principale : Patrick Murphy et Manuel Breuer.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Davis, JL, Kennedy, C., Clerkin, S. et al. La multiomique unicellulaire révèle la complexité de la signalisation du TGFβ à la chromatine dans les organoïdes rénaux dérivés d'iPSC. Commun Biol 5, 1301 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04264-1

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Reçu : 02 décembre 2021

Accepté : 11 novembre 2022

Publié: 27 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-04264-1

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