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Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 3215 (2023) Citer cet article

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Nos études précédentes ont montré que la Klebsiella pneumoniae (HiAlc Kpn) fortement productrice d'alcool dans le microbiome intestinal pourrait être l'une des causes de la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD). Compte tenu de la résistance antimicrobienne de K. pneumoniae et de la dysbactériose causée par les antibiotiques, la phagothérapie pourrait avoir un potentiel dans le traitement de la NAFLD induite par HiAlc Kpn, en raison de la spécificité ciblant les bactéries. Ici, nous avons clarifié l'efficacité de la phagothérapie chez les souris mâles atteintes de stéatohépatite induite par HiAlc Kpn. Des enquêtes approfondies, y compris les transcriptomes et les métabolomes, ont révélé que le traitement avec le phage spécifique de HiAlc Kpn était capable de soulager la stéatohépatite causée par HiAlc Kpn, y compris le dysfonctionnement hépatique et l'expression de cytokines et de gènes lipogéniques. En revanche, un tel traitement n'a pas provoqué de changements pathologiques significatifs, ni dans les fonctions du foie et des reins, ni dans les composants du microbiote intestinal. En plus de réduire les attaques d'alcool, la phagothérapie a également régulé l'inflammation et le métabolisme des lipides et des glucides. Nos données suggèrent que la phagothérapie ciblant le microbiote intestinal est une alternative aux antibiotiques, avec une efficacité et une sécurité potentielles, au moins dans la NAFLD causée par HiAlc Kpn.

La stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) est l'une des maladies chroniques du foie les plus courantes dans le monde1, qui comprend la stéatose hépatique simple et la stéatohépatite non alcoolique (NASH). La NAFLD peut entraîner une fibrose hépatique, une cirrhose et un carcinome hépatocellulaire si elle n'est pas traitée correctement2. Selon les statistiques, environ 25 % de la population mondiale souffre de NAFLD, tandis que l'incidence de la NASH pourrait augmenter de 56 % dans les 10 prochaines années3,4. Il a été rapporté que de nombreux facteurs pourraient être associés à la NAFLD, notamment l'obésité, le syndrome de résistance à l'insuline et le microbiote intestinal5,6. Nos données précédentes dérivées d'une cohorte chinoise ont révélé que 60 % des patients atteints de NAFLD sont porteurs de Klebsiella pneumoniae (HiAlc Kpn) à forte production d'alcool, qui pourrait être l'une des causes de NAFLD7. La prolifération de HiAlc Kpn pourrait être la cause sous-jacente de la NAFLD car la bactérie peut fermenter les glucides en alcool dans l'intestin. L'alcool produit par HiAlc Kpn (≥30 mmol/L) dans le microbiote intestinal peut être délivré au foie par le système de la veine porte, entraînant une stéatose hépatocytaire et un trouble métabolique des lipides, qui entraînent une NAFLD8,9. Une telle NAFLD causée par HiAlc Kpn a été nommée « stéatose hépatique alcoolique endogène (endo-AFLD) »7.

Malheureusement, il n'y a pas de pharmacothérapie approuvée disponible pour la NAFLD. Les études actuelles se sont principalement concentrées sur le ciblage de l'accumulation de graisse hépatique, du stress oxydatif, de l'inflammation, de l'apoptose, du microbiome intestinal, de l'endotoxémie métabolique et de la fibrose hépatique. Les médicaments potentiels comprennent les inhibiteurs de la lipogenèse de novo, les inhibiteurs de la kinase de signalisation de l'apoptose 1, les antibiotiques macrolides et les antagonistes de la galectine 310,11. Nos données précédentes ont également montré que l'utilisation de bactériophages (phages) ou de certains antibiotiques pour éradiquer sélectivement HiAlc Kpn peut prévenir la stéatohépatite dans les modèles murins expérimentaux7. Ceux-ci suggèrent que le ciblage de HiAlc Kpn pourrait être une thérapie efficace pour l'endo-AFLD. Cependant, la résistance aux antibiotiques de K. pneumonia est un problème sérieux dans la pratique clinique, alors que la plupart des souches HiAlc Kpn sont des bactéries multirésistantes (MDR). Selon une étude clinique multicentrique en Chine, K. pneumoniae représente 66,7 % des entérobactéries résistantes aux carbapénèmes collectées dans 25 hôpitaux de 14 provinces12.

L'efficacité des thérapies connues basées sur l'association avec des antibiotiques aminoglycosides, colistine, fosfomycine et tigécycline est insatisfaisante, tandis que de nouveaux antibiotiques ciblant la pneumonie MDR à K. sont encore en développement13,14. De plus, il a été démontré que le microbiote intestinal joue un rôle important dans les maladies du foie et le métabolisme des lipides via l'axe intestin-foie. Par conséquent, le déséquilibre de la flore intestinale induit par les antibiotiques pourrait entraîner des effets secondaires inconnus et inattendus15,16.

Il a été montré que la thérapie bactériophage a été proposée comme solution pour lutter contre les infections causées par les bactéries MDR17. En principe, les phages sont omniprésents et hautement spécifiques à la souche, et peuvent donc potentiellement être utilisés pour modifier le microbiote. De plus, l'effet positif du phage lytique a été vérifié en clinique18,19,20. Par exemple, l'utilisation de phages ciblant K. pneumoniae associée à une maladie intestinale inflammatoire est capable d'inhiber efficacement la croissance des bactéries, d'atténuer l'inflammation et de soulager la gravité de la maladie21. Une étude récente a en outre montré que le traitement avec des bactériophages ciblant spécifiquement l'Enterococcus faecalis cytolytique diminue la cytolysine dans le foie et abolit les maladies du foie induites par l'éthanol chez les souris humanisées20. L'évaluation des phages ciblés par K. pneumoniae dans l'intestin humain artificiel et chez des volontaires sains a également démontré la résilience, l'innocuité et la viabilité d'un tel traitement21. Pour vérifier davantage l'efficacité potentielle de l'élimination de HiAlc Kpn étiologique pour soulager l'endo-AFLD, le modèle murin établi de stéatohépatite a été utilisé dans la présente étude pour clarifier l'efficacité, les effets secondaires et le mécanisme moléculaire du phage pour le traitement de l'endo-AFLD in vivo . Les données ont montré que le phage spécifique de HiAlc Kpn atténuait le dysfonctionnement hépatique en reprogrammant le microbiote intestinal, ce qui pourrait aider à révéler le mécanisme moléculaire du traitement par phage pour l'endo-AFLD, et offre une perspective unique pour la clinique.

HiAlc Kpn a été défini comme l'agent causal de la NASH accompagnée d'une pancréatite récurrente (RP) d'un homme (50 à 60 ans, sans alcoolisme) à l'hôpital Chaoyang de Pékin, Université médicale de la capitale. Fait intéressant, l'analyse métagénomique a montré que l'abondance de K. pneumoniae dans son microbiote intestinal était approximativement inversement proportionnelle à l'abondance des phages Klebsiella (Fig. S1a, b). De plus, la quantité de K. pneumoniae dans le microbiome du patient était significativement augmentée lors de la phase inflammatoire du patient atteint de NASH en l'absence de traitement antibiotique, tandis que la quantité de phage Klebsiella restait relativement faible. En revanche, la tendance inverse a été observée dans les périodes de récupération du patient.

Pour déterminer si la présence de HiAlc Kpn et de phages était associée à la caractéristique clinique, 16 sujets de notre cohorte précédente, qui étaient atteints de NASH mais sans alcoolisme, ont fait l'objet d'une enquête plus approfondie et d'un suivi. HiAlc et MedAlc (production moyenne d'alcool, qui produit 20 à 30 mmol/L d'alcool) Les souches Kpn ont été isolées à partir d'échantillons fécaux de ces patients avant la perte de poids à l'aide d'une analyse métagénomique (Données supplémentaires 1). Les données ont révélé que la quantité de souches de K. pneumoniae était significativement réduite chez ces patients suivis NASH par rapport aux mêmes patients avant la perte de poids, tandis que la quantité de phages Klebsiella était augmentée dans le microbiote intestinal d'un total de 6 patients (Fig. S1c). Pris ensemble, ces résultats suggèrent qu'il devrait y avoir un équilibre dans les abondances entre K. pneumoniae et Klebsiella phages in vivo. Ces données ont également soulevé la possibilité que le phage puisse atténuer l'inflammation via son autorégulation, ce qui pourrait être un médicament naturel potentiel pour le traitement de l'endo-AFLD.

Pour déterminer si le phage Klebsiella cible spécifiquement HiAlc Kpn mais n'affecte pas d'autres microbiotes in vivo, nous avons criblé les phages Klebsiella en utilisant 86 souches de HiAlc Kpn isolées de patients cliniques NAFLD comme bactéries hôtes. Les résultats ont montré qu'un phage lytique phiW14 (CGMCC n° 23085, GenBank n° OK655936, qui cible spécifiquement HiAlc Kpn HK1) avait la capacité de clivage la plus forte et le spectre d'hôtes le plus étendu. Ainsi, le phage phiW14 et HiAlc Kpn HK1 ont été choisis pour d'autres expériences.

HiAlc Kpn HK1 (ST1536, qui produit 49,7 mmol/L d'alcool) a été initialement isolé chez un patient NASH/RP, ayant des caractéristiques biologiques similaires à HiAlc Kpn TH1 (ST1536, qui produit 60,8 mmol/L d'alcool, GCA_001676825.1), présentant une multidrogue résistant mais sensible à l'imipénème, et provoquant une NAFLD par l'alcool à forte production7. De plus, le phage phiW14 a formé des plaques claires et larges sur un tapis de souche HK1 (Fig. 1a). La microscopie électronique à transmission (MET) a indiqué que phiW14 possède une tête icosaédrique de 50 nm de diamètre et une queue non contractile de 20 nm et appartient aux virus de la famille des Podoviridae (Fig. 1a). La courbe de croissance en une étape a montré que la période de latence de phiW14 était de 10 min, le temps de rafale était de 80 min et la taille moyenne de rafale était de 129 unités formant plaque (PFU) / cellule (Fig. 1b). La multiplicité optimale d'infection (MOI) était de 0,001 de phiW14 vs HK1. À MOI de 10 à 0, 0001, phiW14 a complètement inhibé HiAlc Kpn HK1 (Fig. 1c). Le phage phiW14 a pu infecter 18 des 86 souches HiAlc Kpn à MOI 0,001, qui appartiennent à ST25, ST65, ST86, ST193, ST375, ST1536 et trois nouvelles ST (Données supplémentaires 2). De plus, phiW14 était le plus stable à pH 5 à 10 (Fig. 1d) et à 4 ° C à 40 ° C (Fig. 1e), ce qui pourrait être tolérant aux stress environnementaux. La séquence complète du génome a montré que phiW14 est un ADN double brin circulaire de 50 247 pb avec 79 cadres de lecture ouverts putatifs, mais sans gènes de résistance aux médicaments ou de virulence (Fig. 1f et données supplémentaires 3). De plus, un total de 52 protéines de phiW14 ont été identifiées (données supplémentaires 4) et 26 protéines ont été classées en différentes fonctions biologiques par analyse du groupe de groupes orthologues de protéines (COG), y compris la biosynthèse, la transcription, le mobilome, le transport et le métabolisme. protéines apparentées (Fig. 1g). Le regroupement phylogénétique de grandes protéines terminase distinguait clairement phiW14 des autres familles de phages (Fig. 1h). Pris ensemble, ces résultats suggèrent que phiW14 pourrait être un candidat potentiel pour le traitement de l'endo-AFLD.

a Morphologie et plaques du phage phiW14. b Courbe de croissance en une étape du phage phiW14 (n = 4). c Courbe de destruction du phage phiW14 contre Klebsiella pneumoniae à forte production d'alcool (HiAlc Kpn) HK1 (n = 5). d Stabilité du phage phiW14 dans des conditions de pH (n = 4). e Stabilité du phage phiW14 sous différentes températures (n = 4). f Carte génomique du phage phiW14. g Classification du cluster de groupes orthologues de protéines du phage phiW14. h Arbre phylogénétique basé sur les séquences d'acides aminés de la grande sous-unité de la terminase du phage phiW14. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± SD (n = 6). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour clarifier l'effet du traitement par phage sur l'endo-AFLD, les souris ont été gavées avec le HiAlc Kpn HK1 prétraité avec le phage phiW14 ou phikp15 (souris nourries avec HK1 / phiW14 ou souris nourries avec HK1 / phikp15) (Fig. 2a), dans lequel le phage phikp15 a été utilisé comme contrôle négatif car il ne peut pas lyser HK1 in vitro. De plus, en utilisant les souches HiAlc Kpn HK2 (ST447, qui produit 42,5 mmol/L d'alcool) et HK3 (ST101, qui produit 41,5 mmol/L d'alcool) (les deux ont été isolées chez un patient atteint de NASH) comme hôte bactérien, les phages phikp16 (ciblant HK2) et phikp17 (ciblant HK3) ont été obtenus à partir des matières fécales du patient. En ce qui concerne les souris FMT, des échantillons fécaux du patient mentionné ci-dessus ont également été soumis au même prétraitement effectué par la suite pour être transplantés chez des souris FMT / Phage (Fig. 2b).

a Constructions de souris expérimentales nourries avec Pair, EtOH, HK1, HK1/phiW14 et HK1/phikp15. b Constructions de modèles murins FMT et FMT/phage. c Compositions de microbiote intestinal à base de phylum dans les matières fécales de souris expérimentales. d Abondance de Klebsiella dans les fèces de souris expérimentales (n = 6, P < 0,0001). e Colorations à l'hématoxyline-éosine (HE) et à l'huile rouge O (ORO) de coupes de tissus hépatiques de souris expérimentales. f Concentrations d'alanine transaminase (ALT), d'aspartate transaminase (AST), de triglycéride (TG), de diamine oxydase (DAO) et de D-lactate (D-LA) dans le sérum de souris expérimentales (n = 6, sauf la valeur P de Les niveaux de DAO entre le groupe HK1-fed et HK1/ phiW14-fed est de 0,001, les autres valeurs P < 0,0001). Les valeurs sont exprimées en moyenne ± SD (n = 6 souris/groupe). ANOVA à un facteur, valeur P < 0,01 (**) ou 0,001 (***). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Par rapport aux souris nourries avec un régime chow, HK1 ou EtOH, les souris FMT traitées avec un microbiote fécal portant HiAlc Kpn HK2 et HK3 présentaient une stéatohépatite et évidemment des modifications pathologiques du foie. Le contenu de K. pneumoniae dans les fèces (Fig. 2c, d) et comme indicateurs sérologiques, y compris les niveaux d'alanine transaminase (ALT), d'aspartate transaminase (AST), de triglycéride (TG), de diamine oxydase (DAO) et de D-lactate (D-LA) (Fig. 2f) étaient significativement élevés chez les souris nourries avec HiAlc Kpn, HK1 / phikp15, FMT et EtOH, accompagnant la stéatose hépatique (Fig. 2e). Cependant, aucune anomalie n'a été observée chez les souris nourries avec HK1/phiW14 ou nourries avec FMT/phage, par rapport aux souris nourries par paires. De plus, la composition globale du microbiome intestinal au niveau du phylum n'a pas été affectée par le traitement par les phages (Fig. 2c). Ceux-ci suggèrent que le traitement par phage pourrait prévenir la stéatohépatite, éventuellement en éradiquant spécialement HiAlc Kpn dans le microbiote fécal des souris receveuses.

Pour déterminer s'il existe des effets secondaires inattendus, des souris atteintes de stéatohépatite induite par HiAlc Kpn HK1 ont été traitées avec le phage phiW14 à des doses de 104, 105 et 106 PFU pendant 1, 4 et 7 jours. Les résultats ont montré que l'abondance de Klebsiella était efficacement inhibée par les trois concentrations de phages à tout moment in vivo (Fig. 3a, b). Cependant, d'un point de vue pathologique, une stéatose hépatique significativement atténuée n'a été observée que chez les souris traitées avec le phage en continu pendant une semaine (Fig. 3c). De plus, les indicateurs sérologiques, y compris les niveaux d'ALT, d'AST, de TG, de DAO et de D-LA, ont également été significativement diminués chez les souris des groupes ayant reçu une phagothérapie pendant une semaine (Fig. 3d). Il a été noté qu'il n'y avait aucun effet significatif chez les souris avec un traitement au phage pendant 1 ou 4 jours in vivo.

Des souris atteintes de stéatohépatite (gavages avec HiAlc Kpn pendant 4 semaines) ont été traitées avec le phage phiW14 à 104 (faible concentration, LC), 105 (concentration médiane, MC) et 106 (concentration élevée, HC) pendant 1, 4 et 7 jours . a Compositions de microbiote intestinal à base de phylum dans les matières fécales de souris expérimentales. b Concentrations de Klebsiella dans les fèces de souris expérimentales (n = 6, P < 0,0001). c Colorations HE et ORO de coupes de tissus hépatiques de souris expérimentales. d Concentrations d'ALT, AST, TG, DAO et D-LA dans le sérum de souris expérimentales (n = 6, sauf que la valeur P des niveaux de D-LA entre le groupe nourri avec HK1 et nourri avec LC-7d est de 0,003, et la valeur P des niveaux D-LA entre le groupe HK1-fed et MC-7d-fed est de 0,001, les autres valeurs P < 0,0001). e Coloration HE de coupes de tissus hépatiques, rénaux et intestinaux de souris traitées avec 104 PFU de phiW14. f Concentrations d'ALT, d'AST, de bilirubine totale (TBil), de bilirubine directe (DBil), de bilirubine indirecte (IBil), d'acide biliaire total (TBA), de TG et de cholestérol total (TC) dans le sérum de souris traitées avec 104 PFU de phiW14 ( n = 6). Les valeurs sont exprimées en moyenne ± SD (n = 6 souris/groupe). ANOVA à un facteur, valeur P < 0,01 (**) ou 0,001 (***). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Afin d'évaluer plus avant les effets secondaires de la phagothérapie in vivo, des indicateurs liés aux fonctions hépatique et rénale et des modifications histopathologiques des tissus hépatiques, rénaux et intestinaux ont également été examinés. Les données ont indiqué qu'il n'y avait pas de lésion pathologique évidente telle qu'une dégénérescence cellulaire chez les souris traitées au phage (Fig. 3e). Par rapport aux souris nourries par paires, il n'y a eu aucun changement significatif ni dans les niveaux d'ALT, d'AST, de cholestérol total (TC), de TG, de bilirubine totale (TBil), de bilirubine directe (DBil), de bilirubine indirecte (IBil) ni dans le niveau de l'acide biliaire (TBA) des souris expérimentales traitées avec le phage. Ceux-ci suggèrent que le traitement avec le phage phiW14 pourrait inverser la stéatose hépatique en piégeant HiAlc Kpn (Fig. 3f). Ainsi, toutes les souris atteintes de stéatohépatite induite par HiAlc Kpn ont été traitées avec 104 PFU de phage pendant une semaine dans des expériences ultérieures.

Pour déterminer le mécanisme par lequel le phage atténue l'endo-ALFD, des souris atteintes de stéatohépatite ont été construites par gavage HiAlc Kpn pendant 4 ou 8 semaines. Les souris expérimentales ont ensuite été nourries avec du phage phiW14 ou de l'imipénème pendant une semaine supplémentaire (Fig. 4a). Comme prévu, la stéatose hépatique, les lésions, l'inflammation et les taux d'alcoolémie (BAC) ont été soulagés dans les modèles de souris de 4 et 8 semaines traités soit par le phage, soit par l'antibiotique (Fig. 4b – d). Les traitements par phages et antibiotiques ont également réduit les indices de fonction hépatique endommagée, y compris les niveaux d'ALT, d'AST, de DAO, de D-LA et de TG, bien que certains indicateurs tels que l'ALT n'aient montré aucune différence significative entre les souris atteintes de stéatohépatite et les souris traitées avec des phages ou antibiotique (Fig. 4c). L'expression de 22 cytokines telles que IL-1β, IL-6, IL-10 et TNF-α (Fig. 4d), 5 gènes lipogéniques dont Srebp-1c et Scd-1, et 5 gènes lipolytiques (tels que Pparα et Cyp4a14 ) (Fig. 4e) ont également été régulés après un traitement avec un phage ou un antibiotique. Ces données suggèrent que la phagothérapie pourrait être efficace pour le traitement de la NAFLD causée par HiAlc Kpn. En outre, le HiAlc Kpn et l'alimentation en alcool ont entraîné une perte de poids chez les modèles murins (P < 0,001). Fait intéressant, bien qu'il n'y ait pas de différence statistiquement significative de poids corporel entre les groupes de souris nourries avec HK1 et HK1/phiW14, le poids moyen du groupe de souris nourries avec HK1/phiW14 (25,83 g en 4 semaines, 28,14 g en 8 semaines) était également supérieure à celle du groupe de souris nourries avec HK1 (25,40 g en 4 semaines, 27,02 g en 8 semaines). Ceux-ci suggèrent que le traitement par les phages pourrait améliorer la santé des souris dans une certaine mesure.

a Constructions de modèles murins alimentés par Pair-, EtOH-, HK1-, HK1/phiW14- et HK1/IMP. Les souris ont été gavées avec le bouillon de souche HK1, EtOH ou YPD pendant 4 semaines ou 8 semaines, puis traitées avec le phage phiW14, l'antibiotique imipenem ou le PBS pendant une semaine supplémentaire. Après la construction de modèles murins, les souris ont été euthanasiées pour une analyse ultérieure. b Colorations HE et ORO de coupes de tissus hépatiques de souris expérimentales. c Concentrations d'alcoolémie, ALT, AST, TG, DAO et D-LA dans le sérum de souris expérimentales (n = 6, P < 0,0001). d Concentrations de cytokines dans les tissus hépatiques de souris expérimentales. e Niveaux d'expression relatifs des gènes lipogéniques dans les tissus hépatiques de souris expérimentales (n = 6, P < 0,0001). f Poids corporel des souris expérimentales (n = 6, P < 0,0001). g Compositions de microbiote intestinal à base de phylum dans les matières fécales de souris expérimentales. h Abondance de Klebsiella dans les fèces de souris expérimentales (n = 6, P < 0,0001). Les valeurs sont exprimées en moyenne ± SD (n = 6 souris/groupe). ANOVA à un facteur, valeur P < 0,001 (***). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

De plus, bien que l'abondance de Klebsiella ait diminué de manière significative chez les souris traitées à la fois par le phage et l'antibiotique, les structures de la communauté microbienne étaient différentes entre les deux traitements (Fig. 4g, h). Des changements évidents dans la composition globale du microbiome fécal ont été observés chez les souris traitées avec l'imipénème. Dans un modèle de 4 semaines de souris atteintes de stéatohépatite induite par HiAlc Kpn, le traitement à l'imipénem a réduit l'abondance des Bacteroidetes et des Proteobacteria, mais a augmenté l'abondance des Tenericutes. Dans les modèles de 8 semaines, l'abondance absolue des Firmicutes et des Proteobacteria a diminué chez les souris traitées avec l'imipénem (bien que l'abondance relative ait augmenté). Ainsi, un traitement à long terme avec l'imipénème a provoqué des changements dans la flore intestinale et a même entraîné une dysbactériose, bien qu'un tel traitement ait également éliminé HiAlc Kpn et atténué la stéatohépatite.

Nous avons ensuite analysé les profils du transcriptome et du métabolome dans les foies de tous les groupes. Les résultats ont montré que les souris atteintes de stéatohépatite induite par HiAlc Kpn présentaient des changements significatifs après un traitement par phage ou antibiotique. Après le traitement par les phages, les voies associées à la synthèse musculaire des souris atteintes de stéatohépatite ont été régulées à la hausse, tandis que les voies d'inflammation ou d'apoptose, telles que la voie de signalisation Wnt et les cascades de protéine kinase 1 régulées par le signal extracellulaire ont été régulées à la baisse (Fig 5a, b et Données supplémentaires 5) . En revanche, le traitement par l'imipénème a régulé à la hausse les voies associées aux processus biologiques, mais a régulé à la baisse les voies de l'inflammation et de l'apoptose, y compris la migration des leucocytes et les cascades de protéines kinases activées par les mitogènes (MAPK) (Fig 5c, d et Données supplémentaires 5).

une voie de l'Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG) enrichie en DEG régulés positivement ; b Voies KEGG enrichies en DEG régulés à la baisse comparant des groupes de souris nourries avec HK1 et HK1/phiW14. c Voies KEGG enrichies en DEG régulés à la hausse ; d Voies KEGG enrichies en DEG régulés à la baisse comparant des groupes de souris nourries avec HK1 et HK1/IMP.

De plus, les quantités des métabolites acide citraconique, α-tocophérol et acide sébacique, qui ont été enrichis dans les voies du métabolisme des glycérolipides, ainsi que du glycérol 3-phosphate des voies du métabolisme des glycérophospholipides ont été augmentées, tandis que l'acide L-lactique dans la glycolyse et les voies de la gluconéogenèse étaient diminuées chez les souris traitées avec HK1 / phiW14 nourries, par rapport aux souris atteintes de stéatohépatite induite par HiAlc Kpn (Fig. 6a – e et données supplémentaires 6). De plus, des métabolites, dont le 2,2,2-trichloroéthanol, l'acide digalacturonique et l'acide UDP-glucuronique, qui étaient enrichis en interconversions de pentose et de glucuronate, le métabolisme de l'ascorbate et de l'aldarate et le métabolisme des xénobiotiques par les voies du cytochrome p450, étaient régulés à la hausse chez les souris nourries avec HK1 / IMP (Fig. 6f – j et données supplémentaires 6). Ces données suggèrent que la phagothérapie est efficace sur les souris atteintes de stéatohépatite induite par HiAlc Kpn, peut-être non seulement en ciblant HiAlc Kpn, mais également en régulant l'inflammation, le métabolisme des lipides et le métabolisme des glucides.

une analyse discriminante orthogonale des moindres carrés partiels (OPLS-DA) ; b Diagramme volcanique des métabolites différentiels ; c Voies KEGG enrichies en métabolites régulés positivement ; d Voies KEGG enrichies en métabolites régulés négativement ; e métabolites différentiels entre les groupes de souris nourries avec HK1 et HK1/phiW14. f OPLS-DA ; g terrain volcanique des métabolites différentiels ; h voies KEGG enrichies en métabolites régulés positivement ; i voies KEGG enrichies en métabolites régulés négativement ; j métabolites différentiels entre les groupes de souris nourries avec HK1 et HK1/IMP. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± SD (n = 6 souris/groupe). Des métabolites différentiels avec une valeur P < 0,05 et une valeur VIP > 1 ont été choisis pour l'analyse d'enrichissement de la voie KEGG basée sur Metabo Analyst.

L'effet de la phagothérapie a ensuite été vérifié chez des souris sans germes (Fig. 7a) gavées par la flore intestinale, comme mentionné sur la Fig. 2b. Semblable à l'effet du phage chez les souris SPF, la flore intestinale du patient atteint de NASH a provoqué une stéatohépatite chez les souris sans germes, et la colonisation de K. pneumoniae dans l'intestin a été observée au microscope électronique à balayage (SEM). Après le traitement par phage, les indicateurs associés de la stéatohépatite tels que le séquençage de l'ARNr 16S (Fig. 7b, c), les changements pathologiques (Fig. 7d) et les indicateurs sérologiques (Fig. 7e) ont été atténués, tandis que les souches de K. pneumoniae ont été éliminées dans le intestin de souris sans germe.

a Constructions de modèles murins FMT-, FMT/phage-, FMT/IMP-, EtOH- et Pair-fed. Les souris ont été traitées avec un bouillon FMT, EtOH ou YPD pendant 4 semaines ou 8 semaines, puis gavées avec un phage, un antibiotique imipenem ou du PBS pendant une semaine supplémentaire. Après la construction de modèles murins, les souris ont été euthanasiées pour une analyse ultérieure. b Compositions de microbiote intestinal à base de phylum dans les matières fécales de souris expérimentales. c Abondance de Klebsiella dans les fèces de souris expérimentales (n = 6, P < 0,0001). d Colorations HE et ORO de coupes de tissus hépatiques de souris expérimentales et micrographies au microscope électronique à balayage (SEM) du côlon proximal montrant l'état de colonisation de HiAlc Kpn in vivo chez des souris sans germes gavées pendant 8 semaines. e Concentrations d'ALT, AST, TG, DAO et D-LA dans le sérum de souris expérimentales (n = 6, sauf que la valeur P des niveaux de TG entre le groupe nourri avec FMT et le groupe nourri avec FMT/phage dans le modèle de 4 semaines est 0,006, la valeur P des niveaux de TG entre le groupe nourri avec FMT et nourri avec FMT/IMP dans le modèle de 4 semaines est de 0,021, la valeur P des niveaux de DAO entre le groupe nourri avec FMT et nourri avec FMT/phage en 8 semaines modèle est de 0,001, la valeur P des niveaux de D-LA entre le groupe alimenté par FMT et FMT/alimenté par des phages dans le modèle de 8 semaines est de 0,001, et la valeur P des niveaux de D-LA entre le groupe alimenté par FMT et FMT/ IMP-fed in 8-week model is 0.004, other P values < 0.0001). Les valeurs sont exprimées en moyenne ± SD (n = 6 souris/groupe). ANOVA unidirectionnelle, valeur P < 0,05 (*), 0,01 (**) ou 0,001 (***). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour explorer l'efficacité du phage dans le modèle général de NAFLD, le modèle murin de NASH induit par un régime MCD (déficient en méthionine-choline) a également été inclus dans la présente étude. Comme le montre la figure 8a, les souris ont été randomisées en 5 groupes, y compris MCD-fed, MCD/HK1-fed (MCD-fed et HK1 gavé), MCD/HK1/phiW14-fed (MCD-fed, HK1 et phiW14 gavé) , MCD/phiW14-fed (MCD-fed et phiW14 gavé) et MCS (nourri avec de la méthionine-choline-supplémentée, comme contrôle négatif). D'après les résultats du séquençage de l'ARNr 16S (Fig. 8b, c), des changements pathologiques (Fig. 8d) et des indicateurs sérologiques (Fig. 8e), le traitement par phage a atténué la stéatohépatite chez les souris avec un régime MCD plus une alimentation HiAlc Kpn, ce qui pourrait refléter l'importante rôle de HiAlc Kpn dans le processus pathogène de la NASH.

a Constructions des modèles murins MCD/HK1-, MCD/HK1/phiW14-, MCD/phiW14, MCD- et Pair-fed. Les souris ont été nourries avec un régime MCD ou MCS, gavées avec HK1 ou PBS pendant 4 semaines ou 8 semaines, puis gavées avec du phage ou du PBS pendant une semaine supplémentaire. Après la construction de modèles murins, les souris ont été euthanasiées pour une analyse ultérieure. b Compositions de microbiote intestinal à base de phylum dans les matières fécales de souris expérimentales. c Abondance de Klebsiella dans les fèces de souris expérimentales (n = 6, P < 0,0001). d Colorations HE, ORO et Masson de coupes de tissus hépatiques de souris expérimentales. e NAS (scores d'activité de la stéatose hépatique non alcoolique) dans les tissus hépatiques et concentrations d'ALT, AST, TG, DAO et D-LA dans le sérum de souris expérimentales (n = 6, sauf la valeur P des niveaux de TG entre les groupe MCD/HK1-fed et MCD/HK1/phiW14-fed dans le modèle de 4 semaines est de 0,004, et la valeur P des niveaux de D-LA entre le groupe MCD/HK1-fed et MCD/HK1/phiW14-fed dans 8- modèle hebdomadaire est de 0,001, les autres valeurs P < 0,0001). Le modèle murin a été réalisé avec 3 expériences indépendantes. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± SD (n = 6 souris/groupe). ANOVA unidirectionnelle, valeur P < 0,05 (*), 0,01 (**) ou 0,001 (***). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

De plus, nous avons observé que le groupe MCD/HK1 avait des changements pathologiques plus sévères dans la stéatose hépatique et l'inflammation par rapport au groupe MCD, et il y avait une occurrence notable de phagocytose cellulaire dans le groupe MCD/HK1 du modèle de 8 semaines (Fig. 8d). Les scores d'activité NAFLD (NAS) ont également montré que le groupe MCD/HK1 avait un score significativement plus élevé (Fig. 8e) que celui du groupe MCD dans le modèle de 8 semaines (P < 0,05). Cependant, il n'y avait pas de différence statistiquement significative dans les indicateurs sérologiques entre les deux groupes. Cela est peut-être dû au fait que bien que la stéatose hépatique dans les deux groupes se soit produite de manière pathologique, peu de changements dans les indicateurs sériques peuvent être observés jusqu'à ce que la maladie progresse vers un stade plus sévère. Ceci, bien sûr, doit être vérifié dans des recherches ultérieures.

Le traitement par phage n'a pas atténué la stéatohépatite chez les souris nourries uniquement avec le régime MCD, ce qui indique probablement qu'il existe des diversités dans les mécanismes pathogènes de la NAFLD. D'autre part, ces données suggèrent également que la phagothérapie pourrait être très spécifique, du moins dans nos modèles animaux de NASH.

On sait que l'intestin est capable d'affecter le foie en connectant le système veineux porte, le système biliaire et les médiateurs du système circulatoire. Par conséquent, du fait qu'il reçoit du sang de la veine porte de l'intestin, le foie est le premier organe affecté par la dysbiose du microbiote intestinal et de ses métabolites. En plus de maintenir l'homéostasie du foie, le microbiote intestinal pourrait également contribuer aux maladies du foie22. De ce point de vue, l'édition du microbiote intestinal peut être une alternative pour un traitement efficace de l'endo-NAFLD causée par HiAlc Kpn. Cependant, les traitements antibiotiques actuels ne sont pas spécifiques à Klebsiella et pourraient provoquer des effets secondaires car ils éliminent également les bactéries commensales bénéfiques23. De plus, la résistance aux antibiotiques de K. pneumoniae est un grave problème mondial, tandis que la plupart des souches HiAlc Kpn sont des bactéries MDR.

La phagothérapie a été appliquée aux types d'infection les plus courants, y compris la bactériémie, l'otite, les infections des voies respiratoires, les infections des voies urinaires, les infections de la peau et des tissus mous et les infections du tractus gastro-intestinal19. La thérapie bactériophage, stratagème alternatif aux antibiotiques, permet de modifier efficacement et spécifiquement le microbiote intestinal24,25. Nos données ont montré qu'il existait un équilibre dynamique dans l'abondance entre les phages K. pneumoniae et Klebsiella présentés dans les matières fécales d'un patient atteint de NASH, suggérant que le phage pourrait être un médicament naturel potentiel pour le traitement de l'endo-AFLD.

Pour clarifier ce concept, nous avons criblé un phage lytique phiW14 et exploré les effets du phage sur l'endo-AFLD causée par HiAlc Kpn. Les données ont montré que phiW14, sans gènes associés à la lysogénie, à la résistance aux antibiotiques ou à la virulence, avait une bonne capacité à lyser la souche HiAlc Kpn HK1, suggérant qu'il pourrait être un phage efficace à usage médical sans effets secondaires évidents. À l'appui, les résultats ont en outre montré que le traitement avec le phage ciblant spécifiquement HiAlc Kpn atténuait la stéatose hépatique, le dysfonctionnement et les troubles immunitaires, mais sans effets secondaires évidents ni changements globaux dans la composition du microbiote intestinal dans un modèle murin de stéatohépatite induite par HiAlc Kpn.

Il est particulièrement intéressant que l'expression de l'interleukine (IL)-10 ait été régulée positivement dans les tissus hépatiques de souris traitées avec le phage phiW14. Il est bien connu que l'IL-10 a un effet anti-inflammatoire et joue un rôle protecteur contre l'apoptose, la nécrose et la fibrose hépatiques26. Une autre étude a également montré que les phages ciblant spécifiquement Staphylococcus aureus et Pseudomonas aeruginosa régulent la production d'IL-10 via des cellules mononucléaires humaines27. Collectivement, nos données suggèrent que la phagothérapie pourrait atténuer la stéatohépatite, éventuellement en ciblant HiAlc Kpn et en améliorant la production d'IL-10. Notamment, une lésion hépatique manifestement soulagée n'a été observée que chez les souris expérimentales traitées par le phage pendant 7 jours continus, mais pas chez celles traitées pendant 1 ou 4 jours. Des études antérieures ont montré que le phage peut être considéré comme un envahisseur potentiel par le système immunitaire et rapidement éradiqué de la circulation systémique28. Ceux-ci suggèrent que l'utilisation à relativement long terme du phage pourrait être un point clé pour le traitement de l'endo-AFLD. D'autre part, les applications de cocktails de phages, d'encapsulation et de phages à haute concentration peuvent aider à surmonter ce problème29. Une étude plus approfondie de la pharmacocinétique du phage sera nécessaire.

L'éthanol endogène produit par HiAlc Kpn augmente la perméabilité intestinale, ce qui conduit à la translocation des molécules de modèle moléculaire associé aux agents pathogènes (PAMP) vers le foie7,9,30. Les PAMP tels que le lipopolysaccharide (LPS) peuvent migrer de l'intestin via la veine porte vers le foie. Le LPS peut être reconnu par des récepteurs de reconnaissance de formes exprimés par les cellules pertinentes du foie, ce qui provoque des lésions hépatiques, une fibrose et une inflammation du foie. Des voies similaires en plus de l'attaque par l'alcool ont été vérifiées pour contribuer au développement de NAFLD30,31. En particulier, les activations de la protéine 3 du récepteur de type NOD (NLRP3) et NLRP6 ont été identifiées comme des stimuli de l'inflammation hépatique, qui provoquent l'activation de la caspase 1, la production de cytokines inflammatoires et les activations du facteur nucléaire-κB (NF-κB) et des voies MAPK. , aboutissant finalement à la mort cellulaire et à la fibrose hépatique32,33. Les profils transcriptomiques des tissus hépatiques des souris expérimentales ont montré que la phagothérapie et l'antibiothérapie diminuaient les voies associées à l'apoptose et à l'inflammation, y compris les régulations de NF-κB, MAPK et la cascade de kinases régulées par le signal extracellulaire, qui sont nécessaires pour l'activation de l'étoile hépatique. cellules)34. Ceux-ci suggèrent que les changements des voies ci-dessus pourraient être imputables à la relaxation de l'endo-AFLD.

Le foie est également un organe métabolique important des lipides et des glucides, tandis qu'une accumulation excessive de lipides et une gluconéogenèse peuvent favoriser la NAFLD35,36. Par exemple, le fructose est à la fois un inducteur et un substrat de la lipogenèse de novo dans le foie, responsable de l'altération de la communication entre le foie et l'intestin. Outre les effets lipogéniques, l'inflammation et le stress oxydatif induits par le fructose sont des facteurs importants de déclenchement de NAFLD37. En termes de métabolomique, nos données ont révélé que le phage soulageait la stéatohépatite en améliorant le métabolisme des glycérolipides, des glycérophospholipides et de divers glucides. Le phage a également régulé à la baisse la glycolyse anaérobie liée au dysfonctionnement mitochondrial, qui serait impliquée dans la pathogenèse de la NAFLD8,9. Une étude récente a également montré que les phages peuvent impacter les profils métabolomiques par des effets en cascade sur les interactions interbactériennes38. Nos données ont également montré que la combinaison de phages avait des effets positifs sur l'inhibition de HiAlc Kpn dans les matières fécales d'un patient atteint de NASH. Bien que la résistance aux phages constitue une menace inévitable pour l'application des phages, de nombreuses études ont démontré que l'utilisation de cocktails de phages peut atténuer ce problème18,39. Encore une fois, des recherches supplémentaires sur l'évolution de la résistance aux phages seront nécessaires pour traiter l'endo-AFLD causée par HiAlc Kpn.

Il convient également de noter que les résultats du modèle NASH induits par le régime MCD. Il n'y avait qu'une différence statistiquement significative dans le score NAS entre le groupe MCD et le groupe MCD/HK1. Bien qu'il n'y ait pas eu de différence statistiquement significative dans les indicateurs sérologiques, les valeurs moyennes des niveaux d'AST/TG/D-LA/DAO des souris du groupe MCD/HK1 étaient toujours supérieures à celles des souris du groupe MCD. De plus, la phagothérapie atténue un certain degré de dommages pathologiques et réduit significativement les concentrations d'indicateurs sérologiques dans le groupe MCD/HK1, ce qui suggère que HiAlc Kpn joue un certain rôle dans le groupe MCD/HK1 construit dans la présente étude. Les souris des groupes MCD et MCD/HK1 présentaient une stéatohépatite sévère, dans laquelle tous les indicateurs sérologiques des souris étaient significativement plus élevés que ceux des souris des groupes nourris avec HK1 ou nourris par paire avec un régime Chow. Tous ces changements indiquent qu'il y a eu formation de lésions hépatiques et de stéatose hépatique chez ces souris expérimentales. L'administration de HiAlc Kpn chez la souris provoque une stéatose hépatique vers une infiltration inflammatoire et une fibrose hépatique, probablement en raison de la production d'éthanol et d'autres métabolites de la bactérie. Même si des changements évidents dans les indicateurs sérologiques peuvent ne pas être observés jusqu'à ce que la maladie progresse vers un stade plus grave. Ceci, bien sûr, doit être vérifié dans de futures recherches.

Ensemble, nos données ont montré que le traitement avec un phage éliminant spécifiquement HiAlc Kpn soulageait la stéatose hépatique sans effets secondaires évidents. Au-delà de la réduction de l'attaque alcoolique, la phagothérapie a également influencé l'inflammation, le métabolisme des lipides et le métabolisme des glucides. Bien que ces données suggèrent que la phagothérapie peut être une alternative efficace et sûre aux antibiotiques, une étude plus approfondie reste à mener pour tester si l'utilisation de phages est une approche efficace pour le traitement des patients atteints d'endo-AFLD. De plus, des études axées sur les cocktails de phages et la résistance aux phages sont également nécessaires.

Tous les participants humains ont signé le formulaire de consentement éclairé dans la présente étude qui a été approuvé par le comité de recherche du comité d'éthique de l'Institut de pédiatrie de la capitale et de l'hôpital Chaoyang de Pékin (numéro de licence 2021320). Tous les participants ont signé un formulaire de consentement éclairé avant d'entrer dans l'étude. Toutes les expériences murines ont été approuvées par le comité d'éthique médicale de l'Institut de pédiatrie de la capitale et réalisées par la personne autorisée avec le numéro de licence DWLL2021009.

HiAlc Kpn a été diagnostiqué comme l'agent causal d'un patient de sexe masculin (50-60 ans) atteint de NASH accompagnée d'une pancréatite récurrente à la clinique. En 2019-2020, le patient a été diagnostiqué quatre fois en phase inflammatoire de la NASH, de sorte que nous avons prélevé 4 échantillons fécaux (les deuxième, quatorzième, seizième et dix-septième échantillons) des phases inflammatoires et 14 échantillons fécaux des phases de récupération en l'absence du traitement antibiotique. Les niveaux d'ALT, d'AST et de GGT du patient étaient respectivement de 63, 96 et 138 U/L (mesurés une seule fois dans le temps en réponse au deuxième prélèvement). Les colorations histologiques de coupes de biopsie hépatique percutanée ont été présentées sur la figure S1b.

De plus, 20 sujets sains et 16 patients NASH sans alcoolisme ont été recrutés, tandis que des échantillons fécaux ont d'abord été prélevés sur ces participants adultes. Chaque patient NASH a reçu une recommandation de perte de poids pendant trois mois, et les matières fécales de ces patients ont été soumises à une collecte.

Les changements dynamiques de l'abondance des phages Klebsiella et Klebsiella intestinaux du patient ont été surveillés à l'aide du séquençage du microbiote fécal sur la plateforme Illumina Hi-seq (OE Biotech Corp., Shanghai, Chine), comme indiqué précédemment40.

Après avoir cultivé des souches Kpn dans un bouillon YPD (contient 2% de glucose) pendant 12 h, les surnageants de culture ont ensuite été collectés pour déterminer la production d'alcool à l'aide de la chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS) sur la plate-forme de détection à ionisation de flamme Agilent 6850. Les souches produisant ≥30 mmol/L d'alcool ont été définies comme HiAlc Kpn, tandis que les souches produisant ≥20 mmol/L d'alcool ont été définies comme MedAlc Kpn. Le bactériophage a été isolé des matières fécales en utilisant la souche HiAlc Kpn HK1 comme souche hôte. Un gramme de matières fécales non traitées prélevées sur le patient atteint de NASH a été mis en suspension dans 50 ml de tampon salin tamponné au phosphate (PBS) et centrifugé pour éliminer les grosses particules. Ensuite, le surnageant a été passé à travers un filtre à seringue de 0, 22 μm, tandis que le filtrat a été davantage co-cultivé avec la souche hôte dans un essai de plaque de superposition de gélose double. Le phage répondant a été conservé au Centre général de collecte de cultures microbiologiques de Chine (CGMCC) et nommé phiW14 (CGMCC n° 23085).

Les particules de phage ont été colorées négativement avec de l'acide phosphotungstique à 2 % et utilisées pour l'observation morphologique par MET. Le phage phiW14 a été ajouté aux bactéries en phase logarithmique à 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, 1 et 10 dans le dosage du MOI optimal. Pour les expériences de croissance en une étape, la souche hôte HK1 a été infectée par phiW14 au MOI optimal. La taille de la rafale de phiW14 a été calculée par le rapport du nombre final de phages PFU au nombre initial d'unités formant colonies bactériennes (UFC). La capacité lytique de phiW14 vis-à-vis de la souche hôte HK1 a été testée à MOI 0,0001–10. Pour l'analyse de stabilité, le phage phiW14 a été cultivé dans un bouillon Luria-Bertani avec un pH de 1 à 14 et une température de 4 à 80 °C, respectivement. L'ADN génomique du phage phiW14 a été extrait en utilisant la méthode au phénol-chloroforme, comme décrit précédemment41. Le séquençage du génome entier de l'ADN de phage purifié a été réalisé sur la plateforme Illumina NovaSeq (Berry Genomics Corp., Pékin, Chine)42,43. L'annotation du génome a été réalisée à l'aide des logiciels PHASER (http://phaster.ca/) et Prokka, et un arbre phylogénétique basé sur les séquences d'acides aminés de la grande sous-unité terminase a été construit à l'aide du logiciel MEGA44,45. Le protéome du phage a été analysé sur une plateforme SCIEX TripleTOF 5600 (Beijing Genomics Institution, Shenzhen, Chine), tandis que les protéines identifiées ont été classées par analyse COG46.

Des souris C57BL/6J mâles exemptes de pathogène spécifique (SPF) (âgées de 6 à 7 semaines, Charles River Corp., Pékin, Chine) ont été utilisées pour établir des modèles murins comme décrit précédemment7. De plus, des modèles murins ont également été mis en place à l'aide de souris germfree. En bref, des souris C57BL/6J exemptes de germes ont été élevées dans des conditions axéniques dans un isolateur (Class Biologically Clean, Madison, WI, USA) et ont été maintenues sur un cycle jour/nuit de 12h12 avec un accès constant à la nourriture et à l'eau. À l'exception des modèles murins de NASH (nourris avec le régime MCD (Research Diets Corp., New Jersey, USA), un groupe de souris nourries avec le régime MCS (Research Diets Corp., New Jersey, USA) a été utilisé comme contrôle négatif). Toutes les souris ont été nourries avec le même régime tout au long de l'expérience. Ingrédient naturel NIH #31M Rodent Diet en tant que régime Chow standard contenant 35,17 % de blé entier moulu, 20 % de maïs jaune entier moulu, 10 % d'avoine entière moulue, 10 % de farine de ghee, 9 % de farine de poisson (60 % de protéines), 5 % de soja farine (47,5 % de protéines), 2,5 % d'huile de soja (sans additifs), 2 % de farine de luzerne (17 % de protéines), 2 % de farine de gluten de maïs (60 % de protéines), 1,5 % de phosphate dicalcique, 1 % de levure sèche de bière, 0,50 % de calcaire broyé, 0,50 % de sel, 0,25 % de prémélange de vitamines NIH #31, 0,25 % de prémélange de minéraux NIH #31, 0,13 % de chlorure de choline, 0,10 % de L-lysine, 0,10 % de DL-méthionine, mais sans désoxycholate. Vous trouverez plus de détails sur le régime pour rongeurs NIH #31M sur le site Web (Taconic Biosciences, https://www.taconic.com/quality/animal-diet/). Pour conserver un phénotype cohérent de souris expérimentales, toutes les souris C57BL / 6 J ont également été nourries avec le fourrage désigné mentionné ci-dessus pendant 2 semaines avant les expériences. Pour la stéatohépatite induite par HiAlc Kpn, toutes les souches de K. pneumoniae utilisées dans la présente étude ont été cultivées dans un bouillon extrait de levure-peptone-dextrose (YPD) contenant 2 % de glucose. Les souris ont été inoculées par voie intragastrique une fois tous les 2 jours avec la souche HK1 (107 UFC/200 μL) pendant 4 semaines ou 8 semaines, tandis que les souris ont été gavées avec de l'éthanol (40 %/ 200 μL, dilué par une solution saline) et du bouillon YPD (200 μL) une fois par 2 jours ont été utilisés comme témoins positifs et négatifs, respectivement. Pour les souris FMT, des excréments frais ont été prélevés sur un patient atteint de NASH causée par HiAlc Kpn. La préparation des excréments collectés et du garage des souris a été effectuée comme décrit précédemment7,47. Brièvement, des matières fécales fraîches (180 mg) ont été mises en suspension dans 1 ml de PBS pour une centrifugation à 2000 × g afin d'obtenir les surnageants enrichis en bactéries, qui ont été centrifugés en continu à 15 000 × g pour collecter le microbiote fécal. Les culots de bactéries ont été récupérés et remis en suspension dans du bouillon YPD. Des souris non traitées ont été utilisées comme receveurs et gavées avec 109 UFC de microbiote fécal une fois par jour. Dans le groupe FMT/phage, des souris SPF ont été gavées avec du microbiote fécal prétraité in vitro avec phikp16 et phikp17, tandis que des souris germfree ont été gavées avec du microbiote fécal sans prétraitement avec des phages. Dans les groupes de HK1/phiW14 et HK1/phikp15, les souris ont été gavées avec la souche HiAlc Kpn HK1 prétraitée in vitro avec phiW14 et phikp15, respectivement. Le phage phiW14 (104, 105 ou 106 PFU) ou l'imipénème (200 μg/200 μL) ont été utilisés pour traiter des souris atteintes de stéatohépatite induite par HiAlc Kpn par administration intragastrique pendant 1, 4 ou 7 jours. Tous les phages utilisés in vivo ont été purifiés à l'aide du Detoxi-GelTM Endotoxin Removing Gel (Pierce Corp., Rockford, USA) en suivant les instructions du fabricant.

Les souris ont été mises à jeun toute la nuit et euthanasiées. Les tissus hépatiques, intestinaux et rénaux de souris expérimentales ont été prélevés et fixés dans du formol à 10% (pH 7, 2) pour la coloration à l'hématoxyline-éosine et à l'huile rouge O (Solarbio Corp., Pékin, Chine).

Pour analyser la diversité bactérienne, l'ADN génomique total a été extrait des fèces murines pour le séquençage de l'ARNr 16S (OE Biotech). Les régions variables V3-V4 des ARNr 16S ont été amplifiées pour la construction de la bibliothèque à l'aide des amorces 343F (TACGGRAGGCAGCAG) et 798R (AGGGTATCTAATCCT). Les données brutes ont été prétraitées à l'aide des logiciels Trimmomatic et QIIME pour supprimer les lectures avec des bases ambiguës, les lectures avec des séquences homologues ou des séquences <200 bp48,49. Les données propres acquises ont été regroupées pour générer des unités taxonomiques opérationnelles (OTU) en utilisant une valeur seuil de 97 %. Des lectures représentatives de chaque OTU ont ensuite été annotées et enregistrées dans la base de données Silva50.

Les taux sériques d'ALT, AST, TC, TG, TBil, DBil, IBil et TBA ont été mesurés à l'aide d'un analyseur biochimique automatique Hitachi 7060. Les concentrations de DAO et de D-LA ont été analysées par dosage immuno-enzymatique (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Chine). Des échantillons de sang prélevés dans les veines portes de souris ont été utilisés pour la détermination du BAC à l'aide de l'espace de tête GC-MS.

Les protéines extraites des tissus hépatiques ont été utilisées pour détecter les cytokines (IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-17A, Eotaxine, G-CSF, IFN-γ, CXCL-1, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, RANTES et TNF-α) en utilisant un Bio -Plex Pro Mouse Cytokine Grp I Panel sur le système Bio-Plex MAGPIX.

Les niveaux transcriptionnels relatifs des gènes associés au métabolisme des lipides (gènes lipogéniques Lxrα, Lxrβ, Srebp-1c, Fas et Scd-1 ; gènes lipolytiques Pparα, Aco, Lcad, Cyp4a10 et Cyp4a14) dans les tissus hépatiques ont été déterminés par PCR quantitative en temps réel. L'ARN total a été extrait du tissu hépatique à l'aide du réactif Trizol, puis transcrit à l'aide d'un kit de réactifs PrimeScriptTM avec gDNA Eraser (Takara Corp., Shiga, Japon). L'ADNc acquis a été détecté avec SYBR Green I en utilisant le système ABI QuantStudio6, tandis que les expressions des gènes relatifs ont été calculées par la méthode 2T-ΔΔC51. Les amorces (le gène 18S a été utilisé comme gène de référence) utilisées dans la présente étude sont répertoriées dans les données supplémentaires 7.

L'ARN total du tissu hépatique a été extrait à l'aide d'un kit d'isolation de miARN mirVana (Ambion Corp., Texas) en suivant les instructions du fabricant. Des échantillons avec un numéro d'intégrité d'ARN ≥ 7 ont été utilisés pour la construction de la bibliothèque. Le séquençage du transcriptome a été réalisé sur la plateforme Illumina HiSeq (OE biotech). Le logiciel Trimmomatic a été utilisé pour supprimer les lectures de mauvaise qualité et poly-N, tandis que hisat2 a été utilisé pour cartographier les lectures propres au génome de référence48,52. Les DEG ont été identifiés à l'aide du package DESeq R ; le seuil d'expression différentielle significative était la valeur P < 0,5 et le facteur de changement > 2 ou < 0,5. L'enrichissement de la voie de l'encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG) des DEG a été analysé à l'aide du package R basé sur la distribution hypergéométrique53.

L'analyse métabolomique hépatique a été réalisée par GC-MS à l'aide d'un système de chromatographie en phase gazeuse Agilent7890B et d'un système Agilent5977B MSD (Shanghai Lu-Ming Biotech Corp., Shanghai, Chine). Les métabolites différentiels significatifs ont été déterminés à l'aide d'une analyse discriminante partielle des moindres carrés et d'une analyse discriminante partielle orthogonale des moindres carrés (OPLS-DA). Les valeurs VIP ont été utilisées pour trier les métabolites différentiels. Des métabolites différentiels avec une valeur P < 0,05 et une valeur VIP > 1 ont été choisis pour l'analyse d'enrichissement de la voie KEGG basée sur Metabo Analyst54,55.

Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD et ont été soumises à une analyse de variance unidirectionnelle à l'aide du logiciel SPSS 20.0 (IBM Corp., New York, États-Unis). La différence a été jugée statistiquement significative à une valeur P < 0,05 (*), 0,01 (**) ou 0,001 (***). Toutes les expériences ont été répétées trois fois indépendamment avec un résultat similaire (y compris les résultats des figures 1a, 2e, 3c, e, 4b, 7d, 8d et S1b).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

La séquence du génome entier du phage phiW14 de K. pneumoniae dans cette étude a été déposée au NCBI sous le code d'accession OK655936. Les données de séquence brutes du transcriptome dans cette étude ont été déposées dans les archives de séquences du génome sous le code d'accession PRJCA008648/CRA006357. Les données de séquence brutes du métabolome dans cette étude ont été déposées dans l'Open Archive for Miscellaneous Data sous le code d'accession PRJCA008973/OMIX001072. La gamme d'hôtes bactériens, les cadres de lecture ouverts putatifs, les protéines identifiées du phage phiW14, les caractéristiques des patients cliniques NASH et des témoins sains, les gènes d'expression différentielle des tissus hépatiques chez les souris endo-AFLD, les métabolites différentiels des matières fécales chez les souris endo-AFLD et les amorces utilisées dans cette étude sont fournies dans les données supplémentaires. Les données sources sont fournies avec ce document.

Seebacher, F., Zeigerer, A., Kory, N. & Krahmer, N. Homéostasie des gouttelettes lipidiques hépatiques et stéatose hépatique. Sémin. Cellule Dév. Biol. 108, 72–81 (2020).

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Département de bactériologie, Capital Institute of Pediatrics, 100020, Pékin, Chine

Lin Gan, Yanling Feng, Bing Du, Hanyu Fu, Ziyan Tian, Guanhua Xue, Chao Yan, Xiaohu Cui, Rui Zhang, Jinghua Cui, Hanqing zhao, Junxia Feng, Ziying Xu, Zheng Fan, Tongtong Fu, Shuheng Du, Shiyu Liu, Qun Zhang, Zihui Yu et Jing Yuan

Département d'immunologie, École des sciences médicales fondamentales, Capital Medical University, 100069, Pékin, Chine

Soleil Ying

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Conceptualisation, JY et LG ; méthodologie, LG, YF, BD, HF, ZT, CY, GX, XC, RZ, JC, HZ, JF, ZX, ZF, TF, SD, SL, QZ et ZY ; rédaction—ébauche originale, LG ; rédaction—révision et édition, JY et YS; financement acquisition, JY Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance avec Ying Sun ou Jing Yuan.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Arun Sanyal et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Un dossier d'examen par les pairs est disponible.

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Gan, L., Feng, Y., Du, B. et al. Les bactériophages ciblant le microbiote atténuent la stéatose hépatique non alcoolique induite par Klebsiella pneumoniae fortement productrice d'alcool. Nat Commun 14, 3215 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39028-w

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Reçu : 13 septembre 2022

Accepté : 26 mai 2023

Publié: 03 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-39028-w

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